Анализ<em> Yersinia энтероколитные</em> Эффектор Транслокация в клетки-хозяева с помощью Бета-лактамазы эффекторных Слияния

Типа III секреции системы специализированные белок-экспорт машины, используемые различным родам грамотрицательных бактерий непосредственно доставить бактериально закодированные эффекторные белки в эукариотические клетки-мишени. Хотя сам секреции техника высоко консервативен, специализированные наборы эффекторных белков развивались среди различных видов бактерий, чтобы манипулировать клеточные сигнальные пути и облегчают определенные бактериальные стратегии вирулентности ^1. В случае Yersinia, до семи эффекторных белков, так называемых Yops (Yersinia внешние белки), которые перемещаются по клетки-хозяина контакта и действовать вместе, чтобы разрушить ответов иммунных клеток, таких как фагоцитоз и продукции цитокинов, т.е. разрешить внеклеточный выживаемость бактерий ^2-4. Процесс транслокации строго контролируется на разных этапах ^5. Установлено, что основным активации T3SS инициируется ее контакта с целевой CELL ^6. Однако точный механизм этого возбуждения еще не выяснены. В Yersinia второй уровень так называемого тонкой настройки транслокации достигается вверх или вниз регулирующие деятельность клеточных Ро ГТФ-связывающих белков Rac1 или RHOA. Активация Rac1 например invasin или цитотоксический некротизирующий фактор (CNF Y-Y) приводит к увеличению транслокации ^7-9, в то время GAP (ГТФ активации белка) функцию транслоцируется YopE вниз регулирует Rac1 деятельность и, соответственно, уменьшается перемещение отрицательной обратной связи типа механизма ^10,11.

Допустимые и точные методы являются необходимым условием для расследования, как перемещение регулируется во Yersinia взаимодействия клетки-хозяина. Много различных систем были использованы для этой цели, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Некоторые подходы опираются на лизис инфицированных клеток, но не бактерий различными детергентами с последующим вестерн-блоттинга. Чте Общим недостатком этих методов является то, что незначительные, но неизбежно лизису бактерий потенциально загрязняет клеточного лизата с бактериями-связанные эффекторных белков. Однако обработка клеток протеиназой К деградировать внеклеточных белков эффекторные и последующего использования дигитонина селективного лизиса эукариотических клеток были предложены для минимизации этой проблемы ^12. Важно отметить, что эти анализы в решающей зависит от высокого качества анти-эффекторных антител, которые в основном не в продаже. Попытки использовать поступательные слитые белки эффекторных и флуоресцентные белки, как GFP контролировать перемещение не увенчались успехом вероятно, связано с шаровидным третичной структуры флуоресцентных белков и неспособности секреции аппарата разворачиваться их перед секрецией ^13. Тем не менее, несколько различных репортер теги, как СуА (кальмодулинзависимой аденилатциклазу) домен токсина Bordetella коклюша cyclolysin ¹⁴ или флэшТег были успешно использованы для анализа транслокации. В первом тесте ферментативная активность СуА используется для усиления сигнала внутриклеточного слитого белка, в то время как флэш-тега, очень короткий tetracysteine ​​(4Cys) мотив тег, позволяет маркировки со вспышкой biarsenical красителя, не нарушая процесс секреции ^15.

Подход применяется здесь сообщалось, впервые с Charpentier др., И основана на внутриклеточного превращения красителя CCF4 Фёрстера резонансной энергии передачи (FRET) по перемещаются эффектор ТЕМ-1 бета-лактамазы слитых ¹⁶ (фиг.1А). CCF4 / АМ представляет собой клетку проникающий соединение, в котором производное кумарина (донор) и флуоресцеин фрагмент (акцептор) связаны сердечника цефалоспоринов. При пассивном вступления в эукариотической клетке, не-флуоресцентного этерифицированный CCF4 / АМ соединение обрабатывается сотовой эстераз в заряженном и флуоресцентного CCF4 и тем самым в ловушкев клетке. Возбуждение кумаринового фрагмента при 405 нм приводит к FRET флуоресцеина фрагмента, который испускает зеленую сигнала флуоресценции при 530 нм. После расщепления ядра цефалоспоринов по бета-лактамаз FRET нарушается и возбуждение кумарина фрагмента приводит к синей флуоресценции at460 нм. Различные приложения этого метода были описаны в литературе подсветки его универсальность. Способ позволяет проводить анализ транслокации в пробирке, а также в в естественных условиях, например, метод был использован в качестве модели инфекции мыши, чтобы определить популяции лейкоцитов, предназначенные для транслокации в естественных ^17-19. Считывание сигналов может быть проведено с использованием пластин читателей, анализ FACS или флуоресцентной микроскопии. Следует отметить, что метод также дает возможность контролировать перемещение в в режиме реального времени по живых клеток микроскопии в течение инфекционного процесса ^20,21. Вот флуоресценции лазерной сканирующей микроскопии был применен для readouт флуоресцентных сигналов, поскольку она обеспечивает высокую чувствительность и точность. В частности, способность регулировать окно излучения с нанометровым точностью в сочетании с высокой чувствительных детекторов облегчает оптимизированный обнаружение флуоресценции и свернутое перекрестных помех. Кроме того, это настройка микроскопии могут быть адаптированы для мониторинга в режиме реального времени транслокации и потенциально позволяет для одновременного анализа хозяин-патоген взаимодействия на клеточном уровне.

В этом исследовании ставок транслокации У. энтероколитные штамм дикого типа и мутанта YopE удаление демонстрируя hypertranslocator фенотип ^10,11 были образцово проанализированы.