분석<em> 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로> 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용
Summary
Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.
Abstract
병원성 르시 니아 종을 포함한 많은 그람 음성균이. 진핵 표적 세포에 효과기 단백질을 이동시키다하기에게 유형 III 분비 시스템을 사용한다. 숙주 세포 내부에 효과기 단백질은 박테리아의 수혜 세포 기능을 조작. 더 나은 전위를 측정하는 숙주 세포의 상호 작용, 민감하고 정확한 분석하는 동안 유형 III 분비의 조절을 이해하기 위해 필요합니다. 우리는 여기 르시 니아 enterocolitica 효과기 단백질 단편의 융합에 기초한 어 세이 (예 르시 니아 외 단백질; YopE)의 응용 기술한다. 전좌의 정량 분석을위한 TEM-1 베타 – 락타 마제와이 분석은 세포의 분열에 의존 투과 FRET 염료 전좌 베타 – 락타 마제 융합에 의해 (CCF4 / AM). 형광이 중단 및 쿠마린 부분의 여기 파란색 형광 방출로 연결되어있는 베타 – 락타 마제에 의해 CCF4의 세 팔로 스포린 코어의 절단 후, 쿠마린에서 FRET.이 방법의 다른 어플리케이션의 다양성을 부각 문헌에 기재되어있다. 방법은 마우스 모델에서 생체 외 분석을위한 전위도 생체 예에서 허용한다. 형광 신호의 검출은 플레이트 판독기, FACS 분석 또는 형광 현미경을 사용하여 수행 될 수있다. 다른 예 르시 니아 돌연변이가 HeLa 세포에 이펙터 융합체의 생체 전위에서, 여기에 설명 된 설정에서 레이저 스캐닝 현미경에 의해 모니터링된다. 실시간으로 베타 – 락타 마제 이펙터 융합하여 FRET 기자의 세포 내 변환을 기록하는 강력한 정량적 인 결과를 제공합니다. 우리는 여기서 Y로 증가 전위를 보여주는 대표적인 데이터를 표시 야생형 균주에 비해 enterocolitica YopE 변이체.
Introduction
타입 III 분비 시스템은 직접 진핵 표적 세포 내로 세균 부호화 이펙터 단백질을 제공하는 그람 음성 박테리아에 의해 이용되는 다른 장군 특수한 단백질 수출 기계이다. 분비 기계 자체가 고도로 보존되는 동안 효과기 단백질의 특별한 세트는 셀룰러 신호 경로를 조작하고 특정 박테리아 병원성 1 전략을 용이하게하기 위해 다양한 세균 종에 진화 해왔다. 르시 니아 경우, 일곱 이펙터 단백질, 소위 Yops (르시 니아 외 단백질)까지, 숙주 세포 접촉에 전좌 및 즉 식세포 및 사이토 카인 생산과 같은 면역 세포 반응을 파괴하기 위해 함께 작동되어, 세균의 세포 생존을 허용 2-4. 전위의 프로세스 밀접 다른 단계 5에서 제어된다. 그것은 T3SS의 기본 활성화가 목표 CE에의 접촉에 의해 유발되는 것을 설립LL 6. 그러나,이 개시의 정확한 메카니즘은 아직 밝혀지지된다. 예 르시 니아에서 전위의 소위 미세 조정의 두 번째 수준은 상향 또는 하향 조절 세포의 Rho GTP 결합 단백질 RAC1 또는에서 RhoA의 활성을 얻을 수있다. invasin 또는 세포 독성 괴사 인자 Y (CNF-Y)에 의해 예를 들면 RAC1의 활성화는 차이가 전좌 YopE의 기능을 (는 GTPase 단백질을 활성화) 동안 RAC1 활동을 하향 조절하고 그에 따라 음의 피드백 유형에 따라 전위를 감소, 증가 전위 7-9 리드 기구 10, 11의.
유효하고 정확한 방법 르시 니아 전좌가 숙주 세포의 상호 작용 동안에 어떻게 조절되는지를 조사하기위한 전제 조건이다. 다양한 시스템들은 특정한 장점과 단점이 각각, 이러한 목적을 위해 사용되어왔다. 일부 방법은 웨스턴 블롯 분석 한 다음 다른 세제에 의해 감염된 세포의 용해가 아닌 박테리아에 의존하고있다. 목이러한 방법의 전자 일반적인 단점은 사소한하지만 피할 수없는 박테리아 용해 잠재적 박테리아 관련 이펙터 단백질과 세포 용 해물을 오염이다. 그러나, 세포 외 이펙터 단백질과 진핵 세포의 선택적 용해에 대한 디기 토닌의 후속 사용을 분해하는 단백질 분해 효소의 K와 세포의 치료는이 문제 (12)을 최소화하기 위해 제안되었다. 중요한 것은, 이러한 분석은 결정적으로 대부분 상업적으로 사용할 수없는 높은 품질의 안티 이펙터 항체에 따라 달라집니다. 시도 형광 단백질의 구형 차 구조 및 분비 13 전에 펼치는 분비 장치의 무능력으로 인해 아마 성공하지 않았다 전좌를 모니터링 GFP 같은 효과기 단백질의 번역 융합체 및 형광 단백질을 사용한다. (14) 또는 플래시 cyclolysin 보르 데 텔라 백일해 독소 그러나 CYA 등 여러 가지 리포터 태그 (칼 모듈 린 – 의존적 아데 닐 레이트 사이 클라) 도메인태그가 성공적으로 전좌를 분석하는데 사용 하였다. 플래시 태그, 매우 짧은 tetracysteine (4Cys) 모티브 태그, 분비 과정을 방해하지 않고 biarsenical 염료 플래시와 라벨을 허용하면서 전 분석에서 CYA의 효소 활성은 세포 융합 단백질의 신호를 증폭하는 데 사용 15.
여기인가 접근하여 CHARPENTIER 외. 처음보고되었고 전좌 이펙터 TEM-1 베타 – 락타 마제 융합체 (16) (도 1a)에 의해 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 염료 CCF4의 세포 변환에 기초한다. CCF4 / AM는 쿠마린 유도체 (도너) 및 형광 부분 (수용체)은 세 팔로 스포린 코어에 의해 연결되는 셀 투과 화합물이다. 진핵 세포로의 수동 입력에 따라, CCF4 / AM 에스테르 화합물은 비 형광 형광 충 CCF4 셀룰러 에스 테라 제에 의해 처리함으로써 갇혀세포 내에서. 530 nm에서 녹색 형광 신호를 방출 형광 잔기에 FRET에서 405 nm의 결과에서 쿠마린 잔기의 여기. 베타 – 락타 마제에 의해 FRET 스포린 코어의 분열 후 중단되고, 쿠마린 잔기의 여진은 at460 nm의 청색 형광 방출에 이르게. 이 방법의 다른 어플리케이션의 다양성을 부각 문헌에 기재되어있다. 상기 방법은 시험관 내에서 전위의 분석을 가능하게하고 또한 생체 예에서, 기술은 생체 내에서 17-19 전좌 대상 백혈구 집단을 식별하는 마우스 감염 모델을 사용 하였다. 신호의 판독은 플레이트 판독기, FACS 분석 또는 형광 현미경을 이용하여 수행 될 수있다. 참고로,이 방법은 또한 감염 프로세스 (20, 21) 중 살아있는 세포 현미경으로 실시간 전좌를 모니터링 할 수있는 가능성을 제공한다. 여기 레이저 스캐닝 형광 현미경 readou 도포 했더니형광 신호 t 그것은 높은 감도와 정확성을 제공하기 때문에. 특히, 성능은 고감도의 검출기와 함께 나노 미터 정밀도로 발광 창 형광 검출을 최적화 및 크로스 토크를 최소화하는 것을 용이를 조정한다. 또한이 현미경 설치 전좌 실시간으로 모니터링하도록 구성 될 수 있고, 잠재적으로 세포 수준에서 호스트 병원체 상호 작용의 동시 분석을 허용한다.
(Y)의 연구 전위 요금에 enterocolitica 야생형 균주와 hypertranslocator 표현형을 나타내는 10,11 YopE 결실 변이체는 예시 적으로 분석 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기에 성공적으로 Y로 이펙터 전위의 정량 분석을위한 TEM-1 베타 – 락타 마제 기자 기반 분석을 적용 enterocolitica. 이 민감한 특정하고 비교적 간단한 기술의 많은 다른 변형이 문헌에 기재되어있다. 본 연구에서는 레이저 주사 현미경은 형광 신호의 가장 민감하고 정확한 검출을 수행 하였다. 특히 도너와 억 셉터 염료 및 개별적 조절 검출 대역폭 사이의 크로스 토크에 대한 ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.
Materials
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
Referencias
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