Analyse van<em> Yersinia enterocolitica</em> Effector Translocatie in gastheercellen met behulp van beta-lactamase Effector Fusions

Type III secretie systemen zijn gespecialiseerd eiwit-exportmachines gebruikt door verschillende genera van Gram-negatieve bacteriën bacterieel gecodeerde effector eiwitten rechtstreeks te leveren in eukaryote doelcellen. Terwijl de secretie machinerie zelf is sterk geconserveerd zijn gespecialiseerde reeksen effector eiwitten ontstaan ​​tussen de verschillende bacteriesoorten cellulaire signaalwegen te manipuleren en specifieke bacteriële virulentie strategieën ¹ vergemakkelijken. Bij Yersinia, maximaal zeven effector eiwitten, zogenaamde YOPS (Yersinia buitenste eiwitten), translocatie bij gastheercel contact en samenwerken om immuun cel responsen zoals fagocytose en cytokineproductie, namelijk ondermijnen, op extracellulaire overleven van de bacteriën mogelijk ^2-4. Het proces van translocatie wordt streng gecontroleerd in verschillende stadia ^5. Er is vastgesteld dat de primaire activering van de T3SS wordt geactiveerd door het contact met het doel cell ^6. De precieze mechanisme van deze initiatie moet nog worden opgehelderd. In Yersinia een tweede niveau van zogenoemde fine-tuning van translocatie wordt bereikt door omhoog of omlaag reguleren van activiteit van de cellulaire Rho GTP-bindende eiwitten Rac1 of RhoA. Activering van Rac1 bijvoorbeeld door invasine of cytotoxische necrotiserende factor Y (CNF-Y) leidt tot een verhoogde translocatie ^7-9, terwijl de GAP (GTPase activerend eiwit) functie van de translocatie YopE down-reguleert Rac1 activiteit en bijgevolg vermindert translocatie door een negatieve feedback soort mechanisme ^10,11.

Valide en nauwkeurige methoden zijn een voorwaarde om te onderzoeken hoe translocatie tijdens Yersinia gastheercel interactie wordt gereguleerd. Vele verschillende systemen zijn gebruikt voor dit doel, elk met specifieke voordelen en nadelen. Sommige benaderingen afhankelijk lysis van geïnfecteerde cellen maar geen bacteriën door verschillende detergentia, gevolgd door Western blotanalyse. The gemeenschappelijke nadeel van deze methode is dat kleine, maar onvermijdelijke bacteriële lysis mogelijk vervuilt het cellysaat met bacteriën-geassocieerde effector proteïnen. Echter, behandeling van cellen met proteinase K extracellulaire effector eiwitten en het daaropvolgende gebruik van digitonine voor selectieve lysis van de eukaryotische cellen afbreken voorgesteld om dit probleem te ¹² minimaliseren. Belangrijk is dat deze assays mate afhangen van hoogwaardige anti-effector antilichamen, die meestal niet in de handel verkrijgbaar. Pogingen om translationele fusies van effector eiwitten en fluorescerende eiwitten gebruiken, zoals GFP translocatie controleren waren niet succesvol waarschijnlijk door de bolvormige tertiaire structuur van het fluorescente eiwitten en het onvermogen van de secretie inrichting om te ontvouwen voor afscheiding ^13. Echter, verschillende reporter tags zoals de cya (calmoduline-afhankelijk adenylaatcyclase) domein van de pertussistoxine Bordetella cyclolysin ^{14 of} de Flash-tag werden met succes gebruikt om translocatie te analyseren. In het eerste assay de enzymatische activiteit van cya wordt gebruikt om het signaal van de intracellulaire fusieproteïne amplificeren, terwijl de Flash tag, een korte tetracysteine ​​(4Cys) motief tag, maakt labeling met biarsenical kleurstof Flash zonder het proces van secretie verstoren ^15.

De hier toegepaste aanpak werd gerapporteerd voor het eerst Charpentier et al. En is gebaseerd op de intracellulaire omzetting van de Förster resonantie energieoverdracht (FRET) kleurstof CCF4 door translocatie effector TEM-1 beta-lactamase fusies ¹⁶ (Figuur 1A). CCF4 / AM is een cel-permeant verbinding waarbij een coumarine derivaat (donor) en een fluoresceïne-groep (acceptor) worden verbonden door een cefalosporine kern. Bij passieve binnenkomst in de eukaryote cel, wordt de niet-fluorescerende veresterde CCF4 / AM verbinding verwerkt door cellulaire esterasen tot de geladen en fluorescerende CCF4 en daardoor gevangenbinnen de cel. Excitatie van de cumarine eenheid bij 405 nm resulteert in FRET het fluoresceïne groep, die een groene fluorescentie uitzendt bij 530 nm. Na splitsing van het cefalosporine kern door beta-lactamase FRET wordt verstoord en excitatie van de cumarine eenheid leidt tot blauwe fluorescentie-emissie at460 nm. Verschillende toepassingen van deze werkwijze zijn beschreven in de literatuur benadrukken zijn veelzijdigheid. De werkwijze maakt analyse van translocatie in vitro en in in vivo, bijvoorbeeld, de techniek gebruikt in een muis infectie model om de leukocyt populaties gericht voor translocatie in vivo ^17-19 identificeren. Uitlezen van signalen kan worden uitgevoerd met behulp plaatlezers, FACS-analyse of fluorescentiemicroscopie. Opmerkelijk is de werkwijze ook de mogelijkheid om te controleren translocatie in real-time door levende cellen microscopie gedurende het infectieproces ^20,21. Hier werd laserscanning fluorescentiemicroscopie aangevraagd readout van fluorescentiesignalen omdat het hoogste gevoeligheid en nauwkeurigheid. Met name de mogelijkheid om het uittreevenster met nanometerprecisie in combinatie met high-detectoren vergemakkelijkt fluorescentiedetectie geoptimaliseerd en minimale overspraak te passen. Daarnaast kan deze microscoop setup worden aangepast voor real-time monitoring van translocatie en mogelijk maakt voor gelijktijdige analyse van gastheer-pathogeen interactie op het cellulaire niveau.

In deze studie translocatie tarieven van een Y. enterocolitica wild type stam en een YopE deletiemutant vertonen een hypertranslocator fenotype ^10,11 werden voorbeeldig geanalyseerd.