Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten
Summary
Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Abstract
Gliazellen im Gehirn haben Astrozyten diverse funktionelle Rolle im zentralen Nervensystem. In Gegenwart von schädlichen Stimuli, Astrozyten ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften, eine so genannte reaktive Astrogliose modifizieren. Hier wird ein Protokoll für die Beurteilung der morphologischen Eigenschaften der Astrozyten wird vorgestellt. Dieses Protokoll umfasst die Quantifizierung der 12 verschiedene Parameter, dh die Fläche und das Volumen der von einem Astrozyten (Astrozyten Gebiet) abgedeckt Gewebe, das gesamte Astrozyten einschließlich Filialen, Zellkörper und Kern sowie Gesamtlänge und die Anzahl der Filialen, die Intensität Fluoreszenz Immunreaktivität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet, und Astrozyten Dichte (Anzahl / 1000 um 2). Hierzu dreidimensionale (3D) konfokale mikroskopische Bilder wurden erzeugt und 3D-Bildanalyse-Software wie Volocity 6.3 wurde für die Messungen verwendet. Rattenhirngewebe, um Beta-Amyloid 1-40 ausgesetzt </sub> (1-40) mit oder ohne einen therapeutischen Eingriff verwendet wurde, um das Verfahren darzustellen. Dieses Protokoll kann auch für 3D morphometrische Analyse anderer Zellen entweder in vivo oder in vitro-Bedingungen verwendet werden.
Introduction
Bei gesunden zentralen Nervensystems (ZNS), spielen Astrozyten eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutflusses, Energiestoffwechsel, synaptische Funktion und Plastizität und extrazellulären Ionen und Neurotransmitter Homöostase 1-3. Darüber hinaus Astrozyten reagieren auf verschiedene schädliche Reize und anormale Zustände wie Trauma, Infektion, Ischämie oder Neurodegeneration über reaktive Astrogliose die durch Hypertrophie, Proliferation und funktionellen Umgestaltung Astrozyten 4,5 gekennzeichnet ist.
Reaktiv Astrogliose kann die Entzündungsreaktion und Reparaturprozesses in der Gewebezüchtung, und daher kann das klinische Ergebnis therapeutischer Maßnahmen beeinflussen. Dementsprechend Astrozyten Aufmerksamkeit von Neuro in den letzten Jahrzehnten als potentielle Ziele für therapeutische Interventionen für eine Vielzahl von Erkrankungen des ZNS erhalten.
Astrozyten haben normalerweise eine Sternform mit gut defined Zweige, die rund um den Soma 6 zu verbreiten. In einem erkrankten Zustand, in dem Gehirn, Astrozyten Verzweigungen verworren und zeigen gequollenen Enden 7, beispielsweise in Gegenwart von Amyloid-beta (Aß).
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Analyse von 3D-Bildern von Astrozyten durch konfokale Mikroskopie erworben. Zwölf verschiedene quantitative Parameter für jeden Astrozyten wurden gemessen: die Flächen und Volumina der Astrozyten-Gebiet (die durch einen überdachten Astrozyten Gewebe), gesamte Zelle (einschließlich Zweigniederlassungen), Zellkörper und Kern; die Gesamtlänge und die Zahl der Filialen; die Fluoreszenzintensität von Antikörpern für Astrozyten Erkennung verwendet; und die Dichte der Astrozyten (Anzahl / 1.000 & mgr; m 2). Zu diesem Zweck verwendeten wir Gehirnschnitten von Ratten, um die Injektion von 1-40 mit oder ohne Genistein Behandlung eines entzündungshemmenden Substanz intrahippocampal belichtet. Das beschriebene Protokoll kann für eine morphometrische verwendet werdenalysis verschiedener Zelltypen in vitro oder in vivo in verschiedenen Bedingungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der aktuellen Protokoll beschäftigten wir 3D-konfokale Morphometrie zu 12 verschiedene Parameter, die mit Astrozytenmorphologie verbunden waren zu bewerten. Hierzu Hippocampusgewebe von Ratten mit 1-40 – induziert wurden Astrogliose, mit oder ohne Vorbehandlung Genistein als entzündungshemmendes Mittel verwendet. Durch Verwendung von 3D-Bildern und morphometrische Software, waren wir in der Lage, die Wirkung von Genistein auf Astrogliose dh der Morphologie von Astrozyten zeigen.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
Referencias
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