3D hidrogel andamios para articular condrocitos cultura y cartílago Generación

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de los sujetos de Stanford Universidad Humanos y aprobados protocolo Junta de Revisión Institucional. 1. Articular condrocitos aislamiento Obtener cartílago de tejidos descartados durante la artroplastia total de rodilla y diseccionar lo descrito previamente 8. Visualmente seleccionar los cóndilos femorales medial o lateral de muestras de cartílago para superficies lisas y hacer la incisión en la superficie del cartílago a través de un escalpelo para eliminar 4-5 mm biopsias de cartílago sin afectar el hueso subcondral. Aislar los condrocitos de la matriz extracelular por la disociación enzimática del tejido con tratamiento O / N con colagenasa purificada. Use 1: 1 relación de la colagenasa II (125 U / ml) y la colagenasa IV (160 U / ml) en medio de crecimiento de condrocitos a 37 ° C. El día siguiente, filtra el tejido digerido que contiene las células disociadas a través de una 70mm poro tamaño de malla de nylon. De lavado dos veces con 20 ml de DMEM / F12 y centrifugar a 600 xg durante 5 min. Placa de los condrocitos aislados a una densidad de 1 x 10 6 células / 60 mm placa de cultivo después de re-suspensión en DMEM / F12 suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 25 mg / ml de ascorbato, 2 mM L-glutamina, antimicrobianos (100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,25 mg / ml de Fungizone). Mantener las placas a 37 ° C y mantener los cultivos de condrocitos primarios como una monocapa de alta densidad antes de la encapsulación en hidrogeles biomiméticos. 2. Biomimetic hidrogel Fabrication NOTA: Este método permite la síntesis de un hidrogel biomimético que contiene poli (etilenglicol diacrilato) (PEGDA, MW 5.000 g / mol), sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA) en DPBS. La adición de fotoiniciador permite reticulación fotoactivado. La composición de hidrogel final contiene 7% de pesajet / volumen (w / v) de PEGDA, 3% w / v de CS-MA, y 0,05% w / v de fotoiniciador. Sintetizar CS-MA por la funcionalización del polímero con grupos metacrilato CS. Preparar la solución tamponada de 50 mM de ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) y cloruro de 0,5 M de sodio (NaCl) disolviendo 1,952 g de MES y 5,84 g de NaCl en 200 ml de agua desionizada (DiH 2 O). Disolver 5 g de sal sódica de sulfato de condroitina en la solución tamponada. Añadir 0,532 g (4,62 mmol) de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 1,771 g (9,24 mmol) de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) (relación molar de NHS: EDC = 1: 2) para la solución y se agita durante 5 min. Añadir 0,765 g (4,62 mmol) de metacrilato de 2-aminoetilo (AEMA) (relación molar de NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) a la solución y mantener la reacción a TA durante 24 h. Se purifica la mezcla mediante diálisis frente a agua desionizada (DIH 2 O) durante 4 días utilizando un tubo de diálisis (12-14 kDa MWCO). Se filtra la purified solución a través de un filtro de 0,22 micras y colocar los tubos abiertos que contienen la solución en el desecador de vacío y O / N. Asegúrese de que todos los tubos están protegidos de la luz. Guarde el polímero disuelto a -20 ° C protegido de la luz y la humedad. 3. La encapsulación de la célula Autoclave las películas y cilíndricos varillas de PCR (para la perforación de los hidrogeles 3D de células con carga) y esterilizar el molde de gel cilíndrica medida por inmersión en 0,2 micras filtrada etanol al 70% en el tejido campana de cultivo bajo luz UV. Sellar el fondo del molde con la película de gel PCR en autoclave sin burbujas o huecos para evitar fugas de aire. Guárdelo en una placa estéril 150 mm. El día antes de la encapsulación de células en hidrogel biomimético, disociar la monocapa de condrocitos de alta densidad con O / N en el tratamiento de colagenasa II y solución de colagenasa IV. Utilice 125 U / ml para la colagenasa II y 160 U / ml para la colagenasa VI en el crecimiento de condrocitos cada mediosa 37 ° C. Tomar un tubo de 50 ml y añadir 5% en peso / volumen (w / v) (diacrilato de etilenglicol) poli (PEGDA, MW = 5000 g / mol), 3% w / v sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA), y 0,05% w / v fotoiniciador en DPBS. Vortex el tubo para mezclar la solución y mantener a un lado. Proteja el tubo de la luz. Recoger las células disociadas en un tubo Falcon 50 ml, contar y centrifugar a 460 xg durante 5 min. Aspirar todos los medios de comunicación desde el tubo de células y añadir el material de gel mixto anterior a las células volver a suspender a una densidad de 15 × 10 6 células / ml. Mezclar 30 veces a fondo y evitar la formación de burbujas de aire. Pipeta 72 l de la suspensión de células de hidrogel o hidrogel solos en el molde de gel cilíndrica a medida e inducir la gelificación través de la exposición a la luz UV (365 nm de longitud de onda) a 3 mW / m 2 durante 5 min. Prepara un poco de solución de hidrogel sin contenido celular. Utilice estas construcciones como controles negativos para el futuro pruebas bioquímicas y mecánicas. Measure la intensidad de la luz UV con un medidor de intensidad de los rayos UV. Para ajustar la intensidad, cambiar la distancia entre la fuente de luz UV y el andamio de hidrogel durante la gelificación. NOTA: Dado que el hidrogel contiene CS, la contribución acelular se resta del contenido de GAG ​​bioquímica de los hidrogeles de células cargado para representar sólo el GAG celular. Utilice un bisturí para cortar la película para fácil de despegar y retire con cuidado. Con la ayuda de las varillas cilíndricas, empujar hacia fuera el gel en una placa de 6 pocillos con 5 ml de DPBS estériles para lavar gel no polimerizado y las células sueltas. Cultura los hidrogeles cargados de células en placas de 24 pocillos que contenían 1,5 ml de medio de crecimiento de condrocitos en cada pocillo. Use una espátula desechable para transferir los hidrogeles lavadas en el pozo. Evaluar la viabilidad celular por muertos viven tinción 24 horas después de la encapsulación utilizando un kit de viabilidad / citotoxicidad. Cultura de los hidrogeles de células cargadas y los hidrogeles vacíos para 3-6 semanas cambiantes de gro condrocitos frescaswth medios cada 2 días antes de la cosecha para los análisis. 4. RNA de extracción y análisis de expresión de genes Aspirar con cuidado los medios de comunicación y poner estéril PBS 1X en el teléfono cargado, así como los hidrogeles de control vacías. Con la ayuda de una espátula estéril, transferir cada hidrogel a un tubo Eppendorf de 1,5 ml limpio y añadir 250 l de Tri-reactivo a cada tubo. Siga las instrucciones del fabricante para aislar ARN. Después de aislamiento de ARN y cuantificación uso 1 g de la misma de cada muestra y realizar una transcripción inversa en ADNc utilizando la alta capacidad de cDNA Transcription Kit inversa. Para la PCR cuantitativa TaqMan Arrays utilizar Expresión Génica para el examen de la expresión de los genes de interés. Normalizar los niveles de expresión génica internamente para GAPDH. Para las condiciones de PCR incluir una incubación de 2 min a 50 ° C para inactivar amplicones anteriores con uracil-DNA glycosylase, seguido por un 1060; min de incubación a 95 ° C para activar la Taq polimerasa. A continuación, realice ciclos cuarenta de PCR, que consta de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C. 5. Los análisis bioquímicos Para cada constructos de células hidrogel cuantificar el ADN y glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) la producción de la siguiente manera. Aspirar con cuidado los medios de comunicación y poner estéril PBS 1X en el teléfono cargado, así como los hidrogeles de control vacías. Pesar un tubo vacío y poner el hidrogel en el interior después de secante en papel de seda y registrar el peso o el peso húmedo de los hidrogeles. Congelar cada hidrogel a -20 ° C en un tubo eppendorf de 1,5 ml por separado para la digestión enzimática y más tarde utilizar una parte alícuota del producto digerido para ejecutar ensayo de Picogreen (para ADN) y el ensayo de azul de metileno-Dimetil (por GAG). Preparar la solución de papainase para la digestión enzimática de los hidrogeles. En primer lugar preparar el tampón PBE pesando 7,1 g de sodio phosphate dibásico (Na 2 HPO 4) y 1,6 g de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA-Na 2). Disolver en 500 ml de dH 2 O, ajustar el pH a 6,5 y filtrar la solución purificada a través de un filtro de 0,22 mm. Disolver 0,035 g de L-cisteína en 20 ml de tampón de PBE. Se filtra la solución y 100 l de enzima papaína estéril. Cuando esté listo para realizar los ensayos, tomar los tubos de -20 ° C y añadir 300 l de la solución de papaína listo para los hidrogeles congelados. Machacar el gel con un mortero y se mezcla bien con la mano del mortero motor. Llevar el volumen a 500 l con solución de papaína adicional. Realice el mismo procedimiento para los geles de control. Se incuba a 60 ° C durante 16 horas 3,9. La solución que contiene el hidrogel digerido por lo tanto se puede utilizar para la cuantificación de ADN y GAG. Mida el contenido de ADN utilizando el ensayo Picogreen con el ADN del fago Lambda de serie siguiente pr del fabricanteotocol. Cuantificar el contenido-GAG sulfatados utilizando el azul de 1,9-dimetilmetileno (DMMB) ensayo de unión de tinte con sulfato de condroitina tiburón de serie 10. Determinar el contenido de GAG ​​dividiendo la cantidad de GAG ​​para el peso húmedo correspondiente. 6. Pruebas Mecánicas Realizar ensayos de compresión no confinada utilizando un sistema de ensayo Instron 5944 equipado con una célula de carga de 10 N. Después de los días deseados de cultivo in vitro, realice la prueba de compresión en el cadalso de células hidrogel y los hidrogeles de control acelular. Sumergir las muestras en un baño de PBS a RT y comprimir a una velocidad de 1% de deformación / seg a una cepa máximo de 15% 11,12 ya que el esfuerzo fisiológico experimentado por tejido de cartílago bajo condición de carga ha sido informado de que el 10-20% 13,14. Crear estrés vs. curvas de tensión y ajuste de la curva utilizando una ecuación polinómica de tercer orden. Determinar las compressive módulo tangente de la curva de ecuación de ajuste a valores de deformación de 15%.