정적 장기 문화를 사용하여 구개 퓨전 공부의 방법
Summary
구개 개발의 연구는 구개열, 엄청난 의료 부담을 부과하고 외관을 손상하는 지속 남길 수 있습니다 출생 결함의 발생에 의해 좌우된다. 우리는 여기서 구개 개발 및 융합에 관련된 다른 신호 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다 배양 구개 선반 기술을 보여준다.
Abstract
구순 구개열은 모든 출생 결함의 가장 흔한 중입니다. 중간 선 상피 솔기를 형성하기 위해 부착 상피로 덮여 중간 엽 선반에서 보조 구개 형태 (MES). 이론은 MES 세포 융합 미각 (1)을, 중간 엽 전이 (EMT), 세포 사멸 및 마이그레이션 상피를 수행하는 것이 좋습니다. MES의 전체 붕괴는 중간 엽 세포를 둘러싼 구개 합류의 마지막 필수 단계입니다. 우리는 구개 장기 배양 방법을 제공한다. 체외 프로토콜 개발이 융합 동안 생물학적 및 분자 프로세스의 연구를 할 수 있습니다. 이 기술의 응용 프로그램은 외인성 화학 약품에 대한 평가 응답, 규제 및 성장 요인과 특정 단백질의 효과를 포함, 수많은 있습니다. 구개 기관 배양 물이 생체 내 연구에서 사용 불가능 개발의 다른 단계에서의 조작을 포함하여 다수의 이점을 갖는다.
Introduction
구강 안면 쪼개진 조각은 가장 지배적 인 두개 안면 기형이다. 또한, 고려 모든 가능한 두개 안면 결함을 가지고,이 신생아 2에서 두 번째로 가장 흔한 선천성 기형이다. 구개 파열은 약 1 미국 (US) 매년마다 700 출생에서 발생, 구개열의 발생 빈도는 갈라진 달에 입맛 또는 3 일 당 쪼개진 조각 15 아이들과 함께 탄생 475 어린이와 동일하다. 어린이의 약 1 %가 매년 전시를 전세계 두개 안면 dysmorphology 어떤 형태의 탄생.
입천장과 입술의 갈라진 틈이 이상이 환자의 평생의 의미와 매우 비싸고 복잡한 절차가 필요합니다. 구강 갈라진 각 환자에 대한 예상 비용은 약 $ 100,000 4입니다. 구순 구개열 환자의 치료는, 두개 안면 외과, 이비인후과, 유전 학자, 마취를 포함하여 의사의 팀이 필요합니다음성 언어 병리학 자, 영양사, 치열 교정, 보철, 심리학자, 신경 외과 및 안과.
palatogenesis에서 보조 구개는 처음에 수직으로 성장하고 혀의 배부 위에 구개 선반 높이를 받아야 쌍의 outgrowths로 발생한다. 해발 고도에 따라, 한 쌍의 구개 선반 (인간의 마우스에서 E14.5 -E15에서와 주 9) 중간 선을 향해 성장한다. 선반 팁을 포함 내측 가장자리 상피 (MEE)는 중간 선 상피 솔기를 형성 준수합니다.
이것은 간엽 합류 할 수 있도록 중간 엽 전이 및 / 또는 아폽토시스에 의해 상피 이어진다. 반대 MEE의 접착은 그 변경 구개 파열을 일으키는 중요한 이벤트입니다. 그러나, 몇몇 연구는 구개 선반 (5)의 초기 접착력을 조사 하였다. 조골 세포로 중간 엽 세포의 분화에 의해 하드 구개 형성한다. 음자리표를 생산할 수있는 미각의 이상 개발T와 함께 또는 입술의 개입없이 입맛.
미각 기관 배양 기술은 지난 30 년 동안 많은 실험실 -6,7- 위해 널리 사용되었다.
이 프로토콜에서 우리는 세부 사항에 구개 해부 및 정적 기관 배양하는 방법을 설명합니다. 움직 기관 배양의 장점은 선반 구개 융합 할 수 있다는 것이다. 이 기술은 많은 융합 및 신호 실험 8,9에 대한 우리의 실험실에서 성공적으로 사용되었다. 기술의 범위는 광대 한 정적 기관 배양 물 시스템은 외인성 화학 물질에 대한 반응의 평가를 포함하여, 필요할 때마다 이용 될 수 있지만, 다른 경로 및 특정 단백질 규제 성장 인자의 효과.
그림 1. 마우스 Palatogenesis. 쥐의 미각의 발달 단계. (BF) 스캔 ELE대표 발달 시간에 차 구개의 ctron 현미경 (SEM). 빨간색 화살표 : 구개 부착 및 융합의 초기 부분을 보여줍니다. 노란색 화살표 : 융합 후 사라집니다 기본 및 보조 입맛 사이의 공간에 포인트 (PLoS의 하나의 허가 카우프만 (11)에서 재 인쇄).
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서의 프로토콜은 배아 일 13.5에서 배아에서 구개 선반을 해부하는 방법을 제공한다. 마우스 배아 구개 가구는 37 ° C에서 95 % O 2, 5 % CO 2 분위기하에 무 혈청 배지에서 배양 하였다. 성공적인 구개 해부는 문화의 완료에 안락사 쥐의 배아 시간의 절차를 수행하는 동안 각 단계에서 여러 요인에 결정적으로 의존한다. 구개 융합을 좌우하는 가장 중요한 요소 중 하나는 기관 배양…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have any acknowledgements.
Materials
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | 100x15mm |
| Center-well organ culture dish | Falcon | #353037 | 60×15 mm |
| Wire triangular grid | Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well. | ||
| Polycarbonate filter | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | Black 0.4 micron, 47 mm |
| Stereo microscope | ZEISS Stemi SR | ||
| Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
| Microdissecting forceps | Dumont Medical | #5 | |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made |
| Surgical currete (spoon spatula) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector laboratory hood | Labconco | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 water Jacket | |||
| Co2 incubator | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fiber optic Light source | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Embedding cassette | Statlab | EC301 | |
| Kim Wipes | VWR | 470173-504 | |
Referencias
- Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, . principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. . Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).
- Kaufman, M. H. . The Atlas of Mouse Development. , (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).
