Метод исследования небных Fusion использует статический органной культуре
Summary
Исследования развития нёба мотивированы заболеваемости нёба, врожденным дефектом, что накладывает огромное бремя для здоровья и может оставить прочный увечья. Мы демонстрируем здесь технику к культуре небных полки, которые могут быть использованы для изучения различных сигнальных путей, участвующих в развитии небной и слияния.
Abstract
Заячья губа и Вкус являются одними из наиболее распространенным из всех врожденных дефектов. Вторичные нёба формы из мезенхимальных полках, покрытые эпителием, что придерживается формирования срединной линии эпителия шов (МЭС). Теории предполагают, что ЭСК следовать эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT), апоптоза и миграции, делая слитый небо 1. Полный распад МЧС является окончательным важным этапом небного слияния с окружающей мезенхимальные клетки. Мы предлагаем способ неба органной культуре. Разработанная в протоколе экстракорпорального позволяет изучение биологических и молекулярных процессов во время слияния. Приложения этой техники являются многочисленными, в том числе оценке реакции на экзогенные химические вещества, воздействию нормативных и факторов роста и специфических белков. Небных культура орган имеет ряд преимуществ, включая манипуляции на разных стадиях развития, что не возможно при использовании в естественных исследований.
Introduction
Орофациальные щели являются наиболее преобладающие черепно-лицевые врожденные дефекты. Кроме того, принимая во внимание все возможные дефекты черепно-лицевых, это второй наиболее распространенной аномалией рождении у новорожденных 2. Расщелиной неба возникают примерно в 1 из каждых 700 рождений в Соединенных Штатах Америки (США) каждый год заболеваемость нёба равна 475 детей, рожденных с расщелиной неба в месяц или 15 детей с расщелинами в день 3. Примерно 1% детей рождается во всем мире каждый год, обнаруживают некоторую форму черепно дисморфологии.
Трещины на небе и губы нужно очень дорогое и сложное процедуру с пожизненными последствиями для пациентов, которые имеют эту аномалию. Ориентировочная стоимость для каждого пациента с устным щели примерно $ 100,000 4. Лечение пациента с расщелиной губы и неба требует команда врачей, включая черепно-лицевых хирургов, оториноларингологов, генетиков, анестезиологов,Речь языке патологи, диетологи, ортодонты, prosthodontists, психологи, нейрохирурги, офтальмологи и.
В palatogenesis, то вторичное нёбо возникает парных выростов, которые изначально растут вертикально и проходят небной повышение годности выше спинки языка. После возвышения, парные небные в полки расти к средней линии (в E14.5 -E15 у мышей и неделю 9 в человека). Медиальный край эпителий (МЭА), которое охватывает наконечник годности придерживается формирования срединной линии эпителия шов.
Это сопровождается эпителиальных к мезенхимальных перехода и / или апоптоза, чтобы мезенхимальных слияния. Адгезия противной МЕЕ является важным событием которого изменение вызывает нёба. Тем не менее, лишь немногие исследования исследовали начальную адгезию небных полках 5. Твердое небо формы по дифференциации мезенхимальных клеток в остеобласты. Аномальная развитие неба может производить Клефт неб с или без участия губ.
Методы Вкус органов культуры были широко используется на протяжении многих лабораториях в течение последних 30 лет 6,7.
В этом протоколе мы опишем в деталях метод рассечения небной и статического органной культуры. Преимущество неподвижной органной культуры является то, что она позволяет небные полки на предохранитель. Этот метод был успешно использован в нашей лаборатории в течение многих термоядерных и сигнализации экспериментов 8,9. Однако объем техники обширна и может быть использован, когда система статического органной культуре требуется, включая оценку реакций на экзогенные химические агенты, эффекты регуляторных факторов роста в различных путей и специфических белков.
Рисунок 1. Мышь Palatogenesis. Стадии развития мышей неба. (БФ) Сканирование элеctron микрофотографии (SEM) вторичного нёба в представительных раз в развитии. Красные стрелки показывают: первоначальную часть небной адгезии и слияния. Желтые стрелки: Точка в пространстве между первичными и вторичными гурманов, которые исчезают после слияния (перепечатано из Kaufman 11 с разрешения PLoS One).
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол в этой статье предоставляет метод рассечения небные полки из эмбрионов на эмбриональной день 13,5. Небной полки из мышиных эмбрионов культивировали в бессывороточной культуральной среде в атмосфере 95% O 2 5% CO 2 при 37 ° С. Успешное небных рассечение критически зависит от нес?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have any acknowledgements.
Materials
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | 100x15mm |
| Center-well organ culture dish | Falcon | #353037 | 60×15 mm |
| Wire triangular grid | Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well. | ||
| Polycarbonate filter | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | Black 0.4 micron, 47 mm |
| Stereo microscope | ZEISS Stemi SR | ||
| Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
| Microdissecting forceps | Dumont Medical | #5 | |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made |
| Surgical currete (spoon spatula) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector laboratory hood | Labconco | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 water Jacket | |||
| Co2 incubator | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fiber optic Light source | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Embedding cassette | Statlab | EC301 | |
| Kim Wipes | VWR | 470173-504 | |
Referencias
- Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, . principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653 (2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. . Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).
- Kaufman, M. H. . The Atlas of Mouse Development. , (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358 (2011).
