Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex vivo enfeksiyon
Summary
The skin is one target tissue of the human pathogen herpes simplex virus type 1 (HSV-1). To explore the invasion route of HSV-1 into tissue, we established an ex vivo infection model of murine epidermal sheets which represent the outermost layer of skin.
Abstract
Insan ana girmek için, herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1), mukoza yüzeyleri, deri ya da kornea engeli aşmak gerekir. HSV-1 hedefleri ilk girişi sırasında keratinositler ve nöronların latent enfeksiyon takip eder epitel, bir ilköğretim enfeksiyon oluşturur. Reaktivasyonu sonra, virüsler deri veya mukozal ülserler veziküller olarak görünür mukokutanöz sitelerde belirgin hale gelebilir. HSV-1 deri veya mukoza işgal ve ulaştığı Nasıl onun reseptörleri tam olarak anlaşılamamıştır. Hücresel düzeyde epidermal doku içine HSV-1 işgali rota araştırmak için, deride primer ve tekrarlayan enfeksiyon siteyi temsil eden fare epidermisin bir ex vivo enfeksiyon modeli kurdu. Tahlil fare deri hazırlanmasını içermektedir. Epidermis dispaz II muamele ile dermis ayrılır. Virüs içeren ortam üzerinde epidermal yüzer tabaka sonra, doku sabittir ve enfeksiyonunun çeşitli zamanlarda İnokulasyonu de görselleştirilebilirHSV-1-erken proteini ICP0 karşı bir antikor ile enfekte olmuş hücrelerin boyanması. ICP0 sentezleyen hücrelerin 1,5 saat İnokulasyonu zaten bazal keratinosit tabakada gözlenebilir. Uzun enfeksiyon süreleri ile enfekte olan hücreleri enfeksiyon bazal keratinositler sınırlı, ancak virüs dokusunda diğer katmanlarına yayılır olmadığını belirten suprabazal katmanlarında tespit edilir. Çeşitli fare modellerinin epidermal sayfaları kullanarak, enfeksiyon protokolü dokusu içine HSV-1 işgali katkıda hücresel bileşenlerin katılımı belirleyen verir. Ek olarak, analiz, ilk giriş adımları müdahale doku inhibitörleri, hücre-hücre yayılması ve virüs üretimini test etmek için uygundur. Burada, detaylı ex vivo enfeksiyon protokol açıklar ve adiponektin-1- veya HVEM eksik fareler kullanarak sonuçlarını sunmak.
Introduction
Herpes simpleks virüsü (HSV) yaşamı tehdit eden enfeksiyonların hafif komplike deri ve mukoza lezyonları, insanlarda çeşitli hastalıklara yol açabilir. HSV tip 1 (HSV-1), baskın olarak daha çok genital enfeksiyonlar 1 neden HSV tip 2 (HSV-2) ise, orofasyal enfeksiyonlar ve ensefalit ile ilişkilidir. HSV, kültür hücreleri girer enfeksiyon başlatır ve viral döl üreten nasıl anlaşılmasında önemli bir ilerleme olsa da, biz hücresel düzeyde 2'de doku içine viral invazyonu yolunun (ler) hakkında çok az şey biliyoruz. HSV deri ya da mukoza enfeksiyonu, farelerin çalışmaları için, tavşan ve gine domuzları, hayvan modelleri olarak kullanılmıştır. Cilt enfeksiyonu intradermal enjeksiyonu ile veya virüs varlığında cilt çizilmemesi tarafından kurulmuş ve hastalık gelişimi virüs üretimi ile ilişkili olduğu saptandı. Bu yöntemler hastalığın patogenezinde çeşitli yönlerini anlamasına yardım ve antiviral ilaçlar değerlendirmek için kullanılır. Tissu'nun HSV enfeksiyonu araştırmake düzeyi organotipik insan derisi modelleri uygulanmıştır. Enfeksiyon oranı, bu Sal kültürlerinde sınırlıdır gibi, enfeksiyon, viral yayılmayı çok çalışma yapılmış ve antiviral bileşenlerin etkileri sadece sınırlı sayıda 3-6 yayınlanmıştır.
Sağlam epitel HSV-1 enfeksiyon esnasında bir rol oynayabilir, hücresel belirleyicilerini karakterize etmek için, sıçangil epidermis 7 ex vivo enfeksiyon çalışmalar için bir protokol kurulmuştur. Cilt yenidoğan veya yetişkin farelerin kuyrukları hazırlandı. HSV-1 virüsü içeren bir ortamda batık bulundu komple deri örnekleri, enfekte olabilir bu yana, biz dispase II muamele ile epidermis, dermis ayrılmış. Virüs içeren ortam üzerinde epidermal tabakaların kayan sonra, enfekte olmuş hücreler, çeşitli katı İnokulasyonu (pi) 7 de epidermal bazal tabakasında, görüntülenebilir. Viral replikasyon a önce tek tek hücrelerin enfeksiyonunun başlamasını görselleştirmek içinnd virüs üretimi, HSV-1 enfeksiyon sırasında ifade edilen ilk proteinlerden biridir enfekte hücre proteini 0 (ICP0) karşı bir antikorla boyanmıştır. ICP0 hücresel lokalizasyonu, erken enfeksiyon sırasında farklı faz geçer. ICP0 viral gen ifadesinin erken aşamasında, nükleer odaklarda mevcut iken, sitoplazma ICP0 bir yerelleştirme enfeksiyonu 8 müteakip bir faz gösterir.
Biz enfeksiyon sırasında çeşitli hücresel faktörlerin potansiyel rolünü test etmek için farklı fare modelleri epidermal yaprak ex vivo enfeksiyon deneyi kullanıldı. Aktin dinamiklerinin önemli bir regülatör olarak Rac1 etkisini gidermek için, biz Rac1 gen 9 bir keratinosit özgü silinmesi ile farelerin epidermis bulaşmış. Bu model epidermal keratinosit katmanları HSV-1 enfeksiyonu verimliliği üzerinde eksik Rac1 sonuçlarını incelemek için bize izin verdi. Yeniden kontrol littermates enfekte epidermis karşılaştırmaRac1 olmaması epidermis 7 bazal tabakasında enfeksiyonun başlaması üzerinde etki gösteren, anlamlı bir fark bozukluk saptanmadı. Daha fazla fare modellerinin kullanımı bize hücresel reseptörler epidermis içine girişini arabuluculuk hangi adrese izin verdi. HSV-1 ile adiponektin-1- ya da HVEM-eksikliği olan farelerde birinden epidermal yaprak bulaşmasını doku içine ilk viral girişi güçlü adiponektin-1 10 varlığına bağlıdır olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, sonuçlar, aynı zamanda HVEM adiponektin-1 10 kadar verimli değildir, sıçangil epidermiste reseptör olarak görev yapabilir göstermektedir.
Epidermal katmanlar durumunda enfekte olan hücreler uzamsal dağılımını çözmek için, doku bölümleri ve epidermal bütün tamponla (Şekil 1) ICP0 tanımının görüntülenmesi. Tüm deri cryosections, hiçbir ICP0-ifade eden hücreler (Şekil 1) tespit edilir. Bunun aksine, epidermal tabakaların cryosections sitoplazmik göstermektedirZaten 3 saat pi (Şekil 1) bazal tabakada ICP0 ifade. Daha sonra zamanlarda, viral görüntülenebilir katmanları suprabazal yayılma. Bazal tabakasında enfekte hücrelerin mekansal dağılımı kolayca epidermal bütün bağlar (Şekil 1) takip edilebilir. HSV-1 100 PFU / hücre de enfeksiyon üzerine, interfolliküler epidermisin bazal keratinositlerin yaklaşık olarak% 50 bir çok enfekte hücreleri nükleer ICP0 ifade Bu zaman noktasında 1.5 saat pi de ICP0 ekspresyonunu göstermektedir. Erken gen ekspresyonunun daha sonraki bir aşamaya işaret sitoplazmaya ICP0 bir yerelleştirme 3 saat pi (Şekil 1) hemen hemen bütün hücrelerde bulunur. Ex vivo HSV-1 enfeksiyonu üzerine bulaşmış hücrelerin görselleştirme Bu modlar inhibitörleri veya doku viral girişi ve yayılması / silinmiş mutasyona uğramış hücre bileşenlerinin etkisini araştırmak için güçlü bir tahlil sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yetişkin C57BL / deri 6 epidermal tabakalar HSV-1 ile enfekte olduğunda daha düşük virüs dozları ilişkili ise, yaklaşık olarak 100 PFU / hücre, daha az enfekte olmuş hücrelerin ve daha yavaş olan interfolliküler epidermisin bazal katmanın hemen hemen bütün hücrelerin enfeksiyonu gözlemlemek Enfeksiyonun ilerlemesi. Genel olarak, saç köklerinin enfekte hücrelerin değişken sayısını göstermektedir; Gelişmekte olan saç köklerini astar oldukça küçük keratinositler çoğu enfekte ise, yeti?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz teknik danışmanlık için B6.A2G-MX1 fareler ve Semra Özçelik sağlamak için Peter Staeheli teşekkür ederiz.
Bu çalışma SFB829 ve KN536 / 16 ile Alman Araştırma Vakfı ve Tıp Köln Fortune Program / Fakülte, Köln Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
Referencias
- Koelle, D. M., Corey, L. Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines. Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Herpes simplex Viruses. Fields Virology. , 1823-1897 (2013).
- Syrjänen, S., Mikola, H., Nykänen, M., Hukkanen, V. In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture. J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).
- Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system. Virology. 230, 236-243 (1997).
- Hukkanen, V., Mikola, H., Nykänen, M., Syrjänen, S. Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture. J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).
- Gescher, K., et al. Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1. Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).
- Petermann, P., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes. J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).
- Everett, R. D., Maul, G. G. HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML. EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).
- Chrostek, A., et al. Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis. Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).
- Petermann, P., et al. Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors. J. Virol. 89, 262-274 (2015).
- McGeoch, D. J., et al. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
- Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells. J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130, 5241-5255 (2003).
- Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-Mörsdorf, D. Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent. PLoS One. 6, e25464 (2011).
- Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner. Virology. 197, 751-756 (1993).
- Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).
- Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane. Biochem. J. 335, 433-440 (1998).
- Yancey, P. G., et al. Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux. J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).
- Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell. 87, 427-436 (1996).
- Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science. 280, 1618-1620 (1998).
- Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease. Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).
- Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).
- Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses. J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).
