Herpes simplex-virus (HSV) kan orsaka en rad sjukdomar hos människor från milda okomplicerade mukokutana lesioner till livshotande infektioner. HSV typ 1 (HSV-1) är dominant associerad med orofaciala infektioner och encefalit, medan HSV typ 2 (HSV-2) mer sannolikt orsakar genitala infektioner ^1. Även om det finns en betydande framsteg i att förstå hur HSV in celler i odling, initierar infektion och producerar viral avkomma, vi vet lite om virus invasionen vägen (s) i vävnaden på cellnivå ^2. För studier av HSV huden eller mukosala infektioner, möss, har kaniner och marsvin använts som djurmodeller. Hudinfektion bildades genom intradermal injektion eller genom att skrapa huden i närvaro av virus och sjukdomsutveckling korrelerade med virusproduktion. Dessa metoder hjälpte till att förstå olika aspekter av sjukdomen patogenes, och används för att utvärdera antivirala läkemedel. För att studera HSV-infektion vid tissue nivå har organotypic mänsklig hud modeller använts. Eftersom hastigheten av infektion är begränsad i dessa flotte kulturer har endast ett begränsat antal studier som undersöker infektion, viral spridning och effekter av antivirala komponenter publicerats ^3-6.

För att karakterisera cellulära bestämningsfaktorer som spelar en roll under HSV-1-infektion i den intakta epitel, har vi etablerat ett protokoll för ex vivo infektionsstudier i murina epidermis ^7. Hud framställdes från nyfödda eller från svansen på vuxna möss. Eftersom HSV-1 inte kunde infektera hela hudprover, vilka nedsänkta i virusinnehållande mediet, separerade vi epidermis från dermis genom dispas II behandling. Efter flytande av epidermala arken på virusinnehållande medium kan infekterade celler visualiseras i epidermal basalskiktet vid olika tidpunkter efter infektion (pi) ^7. För att visualisera initieringen av infektionen i enskilda celler före virusreplikation ennd virusproduktion, färgades vi med en antikropp mot den infekterade-cellprotein 0 (ICP0), vilket är ett av de första proteinerna som uttrycks under HSV-1-infektion. Den cellulära lokaliseringen av ICP0 passerar genom distinkta faser under tidig infektion. Medan ICP0 är närvarande i nukleära foci under ett tidigt skede av viral genexpression, relocalization av ICP0 till cytoplasman indikerar en efterföljande fas av infektion ^8.

Vi använde infektionsanalysen av epidermala ark ex vivo från olika musmodeller för att testa potentiella roll olika cellulära faktorer under infektion. För att hantera effekterna av RAC1 som en viktig regulator av aktin dynamik, smittade vi epidermis hos möss med en keratinocyt specifik deletion av RAC1 genen ^9. Denna modell tillät oss att studera konsekvenserna av bristfällig RAC1 på effektiviteten i HSV-1-infektion hos epidermal keratinocyter skikt. Jämförelsen till infekterade epidermis hos kontrollkull reuppenbarade ingen signifikant skillnad, vilket tyder på att frånvaron av RAC1 hade ingen effekt på inledandet av infektion i basalskiktet av epidermis ^7. Användningen av ytterligare musmodeller tillät oss att ta itu med vilka cellulära receptorer förmedlar inträde i överhuden. Infecting epidermala ark från antingen nectin-1- eller HVEM-saknande möss med HSV-1 avslöjade att den initiala viralt inträde i vävnad är starkt beroende av närvaron av nectin-en ^10. Dessutom, våra resultat visar att HVEM också kan fungera som receptor i murina epidermis, men mindre effektivt än nectin-1 ^10.

För att lösa den geografiska fördelningen av infekterade celler i epidermala skikten, visualisera vi ICP0 uttryck i vävnadssnitt och epidermala hela fästen (Figur 1). I kryosektioner av total hud, inga ICP0-uttryckande celler detekteras (figur 1). Däremot kryosnitt av epidermala ark visar cytoplasmiskICP0 expression i basalskiktet redan vid 3 h pi (figur 1). Vid senare tillfällen, viral spridning till suprabasala lager kan visualiseras. Den geografiska fördelningen av infekterade celler i basalskiktet kan lätt följas i epidermala hela fästen (Figur 1). Vid infektion med HSV-1 vid 100 pfu / cell, cirka 50% av de basala keratinocyter i de interfollikulära epidermis visar ICP0 uttryck vid 1,5 tim pi Vid denna tidpunkt mest infekterade celler uttrycker nukleär ICP0. Den relocalization av ICP0 till cytoplasman som indikerar ett senare skede av tidig genuttryckning är närvarande i nästan alla celler vid 3 h pi (figur 1). Dessa lägen att visualisera infekterade celler efter ex vivo HSV-1-infektion ger en kraftfull analys för att studera effekten av inhibitorer eller av borttagna / muterade cellulära komponenter på viralt inträde och spridning i vävnaden.