Limbo Abordagem-Subretinal injeção de vetores virais para terapia genética em ratos Retinal Pigment Epithelium
Summary
Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.
Abstract
The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.
Introduction
Em oftalmologia, terapia genética surgiu como a modalidade de tratamento em retinopatias hereditárias monogênicas. Há retinopatias herdados associados com genes no epitélio pigmentar da retina (RPE), incluindo Leber amurosis congênita 1,2, retinite pigmentosa 3, 4 e choroideremia. O campo da terapia genética de pesquisa está em expansão em ambos os estudos pré-clínicos e clínicos que utilizam vectores virais tais como vírus adeno -associated (AAV), lentivírus (LV) e adenovírus (Ad) 5. Diferentes vectores virais possuem tropismo diferente na retina. Para uma terapia génica eficaz e segura, vectores virais devem ser cuidadosamente seleccionados de acordo com as células alvo e genes alvo.
A via de entrega de genes, também é importante para a entrega de genes a células alvo eficaz, assim, deve ser cuidadosamente escolhida bem. Os dois métodos mais comuns para entrega intra-ocular de vectores virais são subretinal injeção e injeção intravítrea 6. Este último, injecção intravítrea, tem sido amplamente utilizada para a entrega de drogas para tratar a neovascularização coroidal em molhado degeneração macular relacionada com a idade (AMD) e o edema macular em retinopatia diabética 7. Via intravítrea proporciona uma exposição de vectores virais para a retina interna e vítreo, mas a difusão dos vectores a retina externa é limitada. Por outro lado, a via sub-retiniano fornece a entrega directa de vectores virais para o espaço potencial entre retina e EPR, induzindo uma vesícula localizada. Portanto, a injeção sub-retiniana é actualmente considerado como uma rota mais eficiente para o direcionamento de células fotorreceptoras e RPE. Em termos de abordagem cirúrgica, pars plana é escolhida como uma área segura para injeção intravítrea para evitar danos na retina em pacientes humanos. Por simplesmente modificar essa abordagem para ratos, poderíamos injetar vetores virais subretinally ou intravireally via abordagem de limbo.
Neste vídeoartigo, demonstramos um método fácil e conveniente de injecção sub-retiniana de vectores virais em ratinhos EPR. Após a punção único no limbo posterior para com uma agulha 30 G 1/2, 33 g de uma agulha romba microlitro equipado seringa é inserida no espaço sub-retiniano através do local de punção limbo. Os vectores virais de 1,5-2 ul de volume são injectados para o espaço potencial entre retina e EPR induzir bolhas subretinal. Este procedimento pode ser realizado sob visualização directa utilizando microscópio cirúrgico. A prática repetida irá garantir resultados replicáveis mesmo sem a visualização direta da formação de bolha. Isso vai ajudar os pesquisadores a realizar experimentos precisos e que economizam tempo para entrega gene em camundongos subretinal RPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo de vídeo, descrevemos o limbo abordagem técnica de injeção sub-retiniana em detalhe com resultados representativos de RPE / coróide / escleral flat-mount. Esta é uma técnica fácil e conveniente para a injecção sub-retiniana de vectores virais em EPR. A visualização direta da formação de bolha durante a injeção é um passo importante para a entrega correta para os novatos. Existem algumas técnicas de injeção subretinal introduzidas no Journal of Experiments Visualized 8-10. Espa…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Seoul National University Research Grant (800-20140542), o Programa Pioneer Pesquisa da NRF / MEST (2012-0009544) ea Análise de Tecnologia Programa de Inovação Bio-Signal da NRF / MEST (2009-0090895), ea concessão da NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105mm | WPI | 555583S | |
| 33G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5%-Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun® injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
Referencias
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. Intraocular delivery of recombinant virus. Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. Intravitreal injection of therapeutic agents. Retina. 29 (7), 875-912 (2009).
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B. Gene therapy for blindness. Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
