마우스 망막 색소 상피의 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터의 윤부 접근 - 망막 주입
Summary
Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.
Abstract
The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.
Introduction
안과에서, 유전자 치료는 단일 유전자 상속 망막증의 치료법으로서 등장했다. Leber 씨 선천성 amurosis 1,2, 색소 성 망막염 (3), (4)를 포함 choroideremia 망막 색소 상피 (RPE) 유전자와 연관된 상속 망막 병증이있다. 유전자 치료의 연구 분야는 전임상 연구 및 아데노 -associated 바이러스 (AAV), 렌티 바이러스 (LV) 및 아데노 바이러스 (AD)와 같은 바이러스 벡터를 사용하여 임상 시험 모두에서 확대되고있다 (5). 다른 바이러스 성 벡터는 망막에 다른 친 화성이있다. 안전하고 효과적인 유전자 치료의 경우, 바이러스 벡터 신중 표적 세포와 표적 유전자에 따라 선택되어야한다.
효율적인 유전자 전달이 표적 세포에 대한 유전자 전달의 경로는 따라서 신중뿐만 선택되어야한다, 또한 중요하다. 바이러스 벡터의 인공 전달을위한 가장 일반적인 두 가지 방법이 subret된다원고 판 주입과 유리체 강내 주입 6. 후자 주입술 널리 당뇨 망막 7 습식 노인성 황반변 성 (AMD) 및 황반부 종의 맥락막 혈관 신생을 치료하는 약물 전달을 위해 사용되었다. 유리체 강내 경로 및 내측 망막 바이러스 벡터의 노광을 제공하지만, 외측 망막 벡터의 확산이 제한된다. 한편, 망막 경로 지역화 여과포를 유도, 망막 및 RPE 간의 잠재적 바이러스 벡터 공간으로의 직접 전달을 제공한다. 따라서, 망막 하 주사 현재 시각 세포 및 RPE를 타겟팅보다 효율적인 경로로 간주된다. 수술 방법의 측면에서, 인간 환자 유리체 망막 손상을 방지하기 위해 주입술 안전한 영역으로서 선택된다 갈 거예요. 단순히 쥐에이 방법을 수정하여, 우리는 윤부 접근 방식을 통해 subretinally 또는 intravireally 바이러스 벡터를 주입 할 수있다.
이 비디오에서기사, 우리는 쥐의 망막 색소 상피에 바이러스 벡터의 망막 주사의 쉽고 편리한 방법을 보여줍니다. 30 G 1/2 바늘 윤부에 후방에서 단일 천자 후, 33 G 무딘 바늘 장착 된 마이크로 리터 주사기는 윤부 천자 사이트를 통해 망막 하 공간에 삽입됩니다. 1.5의 바이러스 성 벡터 – 2 μL 볼륨은 망막과 망막 색소 상피가 망막 소포를 유도 사이의 잠재적 인 공간으로 주입된다. 이 절차는 수술 현미경을 사용하는 직접적인 시각화 하에서 수행 될 수있다. 반복 연습도 여과포 형성의 직접 시각화없이 복제 결과를 보장합니다. 이 쥐의 망막 색소 상피에서 망막 유전자 전달에 대한 정확하고 시간을 절약 실험을 수행하는 연구자 도움이 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 비디오 문서에서는, 우리는 RPE / 맥락막 / 공막 평면 마운트의 대표적인 결과를 상세하게 윤부-접근 망막 주입 기술을 설명했다. 이것은 망막 색소 상피에 바이러스 벡터의 망막 주입을위한 쉽고 편리한 기술이다. 주입시 여과포 형성의 직접 시각화는 초보자를위한 정확한 전달을위한 중요한 단계입니다. 시각 실험 8-10의 저널에 소개 된 일부 망막 사출 기술이있다. 망막 하 공간이 망?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구는 서울 대학교 연구 그랜트 (800-20140542)에 의해 지원되었다, NRF / 교육 과학 기술부의 개척자 연구 프로그램 (2012-0009544)과 NRF / 교육 과학 기술부의 바이오 신호 분석 기술 혁신 프로그램 (2009-0090895) 과 NRF / 교육 과학 기술부의 그랜트 (2015M3A9E6028949).
Materials
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105mm | WPI | 555583S | |
| 33G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5%-Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun® injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
Referencias
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. Intraocular delivery of recombinant virus. Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. Intravitreal injection of therapeutic agents. Retina. 29 (7), 875-912 (2009).
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B. Gene therapy for blindness. Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
