Nanoparçacık Toksisite Testi için Kupffer hücre izolasyonu
Summary
Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.
Abstract
In vitro çalışmalar nanotoxicological büyük çoğunluğu onların pratiklik için ölümsüzleştirdi hücre hatları kullandık. Bununla birlikte, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri veya primer hücrelerde nanopartikül toksisite testi sonuçları in vitro deneyler için birincil hücrelerin kullanımını genişletmek için ihtiyaç ortaya farklılıklar göstermiştir. Bu protokol, fare karaciğer makrofaj izolasyonu, adı Kupffer hücreleri ve nanoparçacık toksisitesini incelemek için kullanımlarını tarif eder. Kupffer hücrelerinin vücuttaki en bol bulunan makrofaj popülasyonu ve nanopartiküller dolaşımdaki yakalama sorumlu retiküloendotelyal sistem (RES) bir parçasını oluşturmaktadır. Burada bildirilen, Kupffer hücre izolasyon yöntemi yoğunluk gradyanı üzerinde saflaştırma, ardından 2-aşamalı bir perfüzyon metoduna dayanır. kolajenaz sindirimi ve yoğunluk santrifüj göre yöntem olup, Smedsrød ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir protokolden uyarlanmıştır. sıçan karaciğer hücre, izolasyon için tasarlanmışn ve yüksek bir verim sağlar ve Kupffer hücreleri, yüksek saflıkta (>% 95) (14 x 10 6 fare başına hücre kadar). Bu izolasyon yöntemi sofistike ya da pahalı ekipman gerektirmez ve bu nedenle karmaşıklığı ve hücre verimi arasında ideal bir uzlaşma temsil etmez. ağır farelerde (35-45 gr) kullanılması izolasyon yönteminin verimini artırır ama aynı zamanda son derece portal ven kanülasyonu prosedürü kolaylaştırır. CNT f işlevselleştirilmiş Karbon nanotüplerin toksisite modifiye LDH testi ile bu modelde ölçülmüştür. Bu yöntem, ön-CNT ile inkübasyondan sonra, Kupffer hücre zarı yapısal bütünlüğünün eksikliği ölçülerek hücre canlılığı değerlendirir. F CNT neden olduğu toksisite izole Kupffer hücreleri nanoparçacık toksisite testleri için faydalı olduğu öne bu tahlili kullanılarak sürekli olarak ölçülebilir. Nanotoksikoloji genel anlayış klinik çeviri daha verimli için nanoparçacık seçim yaparak, bu tür modellerden yarar olabilirkatsayısıdır.
Introduction
Nanotoksikoloji araştırması alanı, nanopartiküller biyolojik etkisini belirlemeyi amaçlamaktadır. In vivo araştırmalara dayalı Toksikolojik çalışmalar en doğru yöntemleri kalır. Ancak, bunların kullanımı maliyet, emek ve zaman gereksinimleri 1 ile sınırlıdır. Alternatifler, in vitro tahliller için basitlik ve vitro test platformları 2 yüksek verim yakalanma olasılığı kullanılmıştır gibi – yani test edilen koşullar sayısını uzanır. En nanotoxicological çalışmalar, ölümsüz hücre çizgileri ile in vitro deneyler kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, in vivo toksikolojik etkileri 3 bu deneysel bulguların ekstrapolasyonuna konusunda endişeler vardır. Gerçekten de, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri özellikleri de elde edilmiştir dokular, örneğin, genetik dönüştürme 4, temel morfolojik özelliklerini bozulması önemli ölçüde farklı olabilir5, hücresel polarite 6 ve inflamatuar mediatörlerin 7 düzenlenmesi gibi fonksiyonel değişikliklerin kaybı.
Kupffer hücrelerinin vücuttaki en bol bulunan makrofaj popülasyonu ve karaciğer sinüsoidlerinden duvarını kaplayan kan ile doğrudan temas halinde bulunmaktadır. Retiküloendotelyal sistem (RES) bir parçası olarak, bu makrofajlar nanopartiküller dolaşım ve bu nedenle yakalanması için sorumlu olan, nanopartikül toksisitesini incelemek için son derece uygun bir model teşkil etmektedir. In vivo 8 ve in vitro nanopartiküller maruz Kupffer hücreleri ile ilişkili inflamatuar tepkilerin 9 çalışmaları başka yayınlanmıştır. Kupffer hücreleri aynı zamanda alkolik karaciğer hastalığı 10, karaciğer fibrozis 11 veya viral hepatit 12 olarak karaciğer hastalıklarının patogenezinde yer almış. Bu izole Kupffer hücreleri, hücresel mekanizmalar inv açıklamak için yararlı bilgi sağlar olduğu bildirilmiştirKaraciğer bozulması 13,14 olved.
Çeşitli yöntemler, izole edilmesi ve Kupffer hücrelerinin saflaştırılması için rapor edilmiştir. Hücre izolasyonu, mekanik ya da enzimatik ayrılma 15 kaynaklanabilir. Kollajenaz sindirimi yüksek Kupffer hücre verimi 16 giden ise, Kupffer hücreleri fonksiyonel bütünlüğü muhafaza avantajını gösterir. Karmaşıklığı ve maliyeti değişen pek çok deneysel yaklaşım, diğer karaciğer hücre popülasyonlarından Kupffer hücreleri ayırmak için kullanılmıştır. Örneğin, Kupffer hücre saflık immünoafinite 17, akış elektroforez 18, yapışmayı 16 tarafından ya da bunların büyüklüğü ve yoğunluğuna göre hücreleri seçin santrifüj teknikleri 16, ile elde edilebilmektedir. Bu yöntemlerin bir kombinasyonu nüfusun 16 saflığını geliştirmek için seçilebilir. Çoğunlukla uygulama ve mevcut ekipman bağlı olduğu Kupffer hücre izolasyonu için ideal yöntem hakkında görüş birliği yokturt. Bununla birlikte, nanopartikül toksisite testi durumunda, basitliği ve Kupffer hücreleri fonksiyonlarının korunması ile bağlantılı teknik yüksek verimi, bu uygulama için en uygun olduğu ortaya çıktı.
Burada bildirilen, Kupffer hücre izolasyon yöntemi yoğunluk gradyanı üzerinde saflaştırma, ardından 2-aşamalı bir perfüzyon metoduna dayanır. yöntem Smedsrød ve arkadaşları tarafından geliştirilen özgün protokolden modifiye edildi. 16 sıçan karaciğer hücre izolasyonu için tasarlanmış. Çalışmaların çoğu rapor ve sıçan ciğeri Kupffer hücrelerinin izolasyonu nitelendirdi. Burada, yüksek verim ve saflıkta, fare karaciğerinden Kupffer hücreleri izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. farelerin kullanılması deney maliyetini düşürür ve çeşitli karaciğerinin işleme nanoparçacık toksisite testleri için Kupffer hücreleri büyük miktarlarda elde etmesini sağlar.
Aşağıdaki protokol, Kupffer hücreleri (f işlevselleştirilmiş C-nanotüpler ile inkübe edildi </em> CNT). CNTs özel fiziko-kimyasal özelliklere – tedavisi ve teşhis amaçları için vektörler olarak CNTs ilgi çekici adaylardır yapmış, çap oranı ve geniş yüzey alanı yüksek uzunluğa yani. Ancak, endişeleri CNTs 19 toksisitesi, ve in vitro testlerde yeni gelişme CNT biyolojik etkisinin anlaşılmasını artırmayı hedefliyor ilgili gündeme gelmiş. Kupffer hücre içinde toksisite, hücre zarının yapısal bütünlüğünün eksikliği ile bağlantılıdır. Bu yüzey maddesine hücreden sitoplazmik enzimin LDH kaybı ile ölçülür. Bu yöntemin prensibi, bu nedenle, herhangi bir serbest LDH çıkarın ve hücreleri 20 kalanları ölçmektir. Üstte kalan sıvı kısımdaki CNTs varlığının tayinin 21 müdahale, bu süpernatan içinde salınan LDH ölçülmesi tercih yapılır.
Biz bu basit ve uygun maliyetli Kupffer hücre izolasyonu metho kullanımını öneriyoruzD fonksiyonel Kupffer hücreleri çok sayıda izole etmek. Bu, ilgili primer makrofaj modelinde, nanopartiküller bir dizi toksisite tarama sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aşağıdaki adımlar, yüksek verim ve Kupffer hücreleri yüksek canlılığı elde etmek için kritiktir. Aseptik koşullar bakteriyel ve fungal kirlenme riskini sınırlamak için kullanılır. Tüm araçlar kullanılmadan önce sterilize edilmesi gerekir. Reaktifler taze izolasyon prosedürü gerçekleştirmeden önce hazırlanmalıdır.
kollajenaz IV seçimi, düşük triptik aktivite ile, çok önemlidir. Aynı ilgili farklı birçok farklı enzimatik aktiviteye sahip olan ve Kupffer …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.
Materials
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | – | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll®) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96®) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. | ||
Referencias
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -. W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
