Kupffer Zelle Isolierung für die Toxizität von Nanopartikeln Testing
Summary
Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.
Abstract
Die große Mehrheit der in-vitro-Studien haben nanotoxikologische immortalisierten Zelllinien auf ihre Praxistauglichkeit verwendet. Jedoch haben Ergebnisse aus Nanopartikeln Toxizität in immortalisierten Zelllinien oder primäre Zellen Diskrepanzen zeigt, die die Notwendigkeit, die Verwendung von primären Zellen für in vitro-Assays zu erweitern. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Mausleber Makrophagen, Kupffer-Zellen genannt, und ihre Verwendung zur Toxizität von Nanopartikeln zu untersuchen. Kupffer-Zellen sind die häufigsten Makrophagenpopulation im Körper und Teil des retikuloendothelialen Systems (RES), für die Erfassung von zirkulierenden Nanopartikel verantwortlich. Die Kupfferzellen Isolierverfahren hier berichtet wird, auf einem 2-Schritt-Perfusionsverfahren, gefolgt von Reinigung über Dichtegradientenzentrifugation basieren. Wobei das Verfahren, bezogen auf Kollagenaseverdau und Dichte der Zentrifugation wird der von Smedsr d et al ursprüngliche Protokoll angepasst. für Rattenleberzell isolatio ausgelegtn und bietet hohe Ausbeute (bis 14 x 10 6 Zellen pro Maus) und hoher Reinheit (> 95%) von Kupffer-Zellen. Diese Isolierung Methode erfordert keine teure Ausrüstung oder anspruchsvoll und stellt somit einen idealen Kompromiss zwischen Komplexität und Zellausbeute. Die Verwendung von schwereren Mäuse (35-45 g) die Ausbeute an dem Isolierungsverfahren, sondern erleichtert auch bemerkenswert, das Verfahren der Pfortader Kanülierung. Die Toxizität von Kohlenstoffnanoröhren f -CNTs wurde in diesem Modell durch das modifizierte LDH-Assay gemessen. Dieses Verfahren bewertet die Lebensfähigkeit der Zellen durch Messen der Mangel an struktureller Integrität Kupffer Zellmembran nach Inkubation mit f -CNTs. Toxizität von f induzierte -CNTs konsistent mit diesem Assay gemessen werden, Hervorhebung, dass isolierte Kupffer-Zellen sind für die Prüfung der Toxizität von Nanopartikeln. Das Gesamtverständnis der Nanotoxikologie können von diesen Modellen profitieren, so dass die Nanopartikel-Auswahl für die klinische Übersetzung effizient.
Introduction
Der Bereich der Toxikologie Forschung zielt auf die biologische Wirkung von Nanopartikeln zu charakterisieren. Toxikologische Untersuchungen auf Basis von in vivo Untersuchungen bleiben die genauesten Methoden. Allerdings ist ihr Einsatz durch ihre Kosten, Arbeit und Zeitaufwand 1 beschränkt. Als Alternative, in vitro-Assays wurden aufgrund ihrer Einfachheit und der Möglichkeit der Entwicklung von Hochdurchsatz in vitro Testplattformen 2 verwendet wurden – so Erweiterung der Anzahl von Bedingungen getestet. Esten nanotoxikologische Untersuchungen werden mit Hilfe von in-vitro-Assays mit immortalisierten Zelllinien. Es gibt jedoch Bedenken hinsichtlich der Extrapolation dieser experimentellen Befunde in vivo toxikologische 3. Tatsächlich können die Eigenschaften der immortalisierten Zelllinien signifikant von Geweben sie abgeleitet wurden, zum Beispiel genetische Transformation 4. Verschlechterung von wichtigen morphologischen Merkmale sein5, Verlust der Zellpolarität 6 und funktionellen Veränderungen wie die Regulierung von Entzündungsmediatoren 7.
Kupffer-Zellen sind die häufigsten Makrophagenpopulation im Körper und sind in direktem Kontakt mit Blut durch Auskleiden der Wand Lebersinusoide. Als Teil des retikuloendothelialen Systems (RES), sind diese Makrophagen für die Erfassung von zirkulierenden Nanopartikel und damit verantwortlich, bilden eine sehr geeignetes Modell, um die Toxizität von Nanopartikeln zu untersuchen. In vivo 8 und In-vitro-Studien 9 von Entzündungsreaktionen mit Kupffer-Zellen zu Nanopartikeln ausgesetzt zugeordnet wurden an anderer Stelle veröffentlicht. Kupffer-Zellen wurden ebenfalls in der Pathogenese von Lebererkrankungen wie alkoholische Leberkrankheit 10, Leberfibrose 11 oder Virushepatitis 12 beteiligt. Es wurde berichtet, dass isolierte Kupffer-Zellen liefern nützliche Einblicke in zelluläre Mechanismen inv beschreibenLeberstörungen 13,14 olved.
Mehrere Verfahren wurden berichtet, zu isolieren und zu reinigen, Kupffer-Zellen. Zellisolierung aus mechanischen oder enzymatischen Dissoziation 15 führen. Kollagenaseverdau zeigt den Vorteil, dass die Erhaltung der Funktionsfähigkeit der Kupffer-Zellen, während die zu hohen Kupffer Zellausbeute 16. Viele experimentelle Ansätze unterschiedlicher Komplexität und die Kosten, sind verwendet worden, um den Kupffer-Zellen von anderen Leberzellpopulationen zu trennen. Beispielsweise kann Kupfferzelle Reinheit durch Immunoaffinitätschromatographie 17. Strömungs Elektrophorese 18, 16 oder selektive Adhäsion durch die Zentrifugalkraft Techniken 16, die Zellen auszuwählen entsprechend ihrer Größe und Dichte erreicht werden. Eine Kombination dieser Verfahren kann gewählt werden, um die Reinheit der Bevölkerung 16 zu erhöhen. Es besteht kein Konsens über die ideale Methode für die Kupffer-Zellisolierung, da sie größtenteils abhängig von der Anwendung und den verfügbaren equipment. Im Falle von Nanopartikeln Toxizitätstests, die Einfachheit und eine hohe Ausbeute der Technik mit der funktionellen Erhaltung Kupffer Zellen assoziiert ist jedoch zu dem als am besten geeignet für diese Anwendung.
Die Kupfferzellen Isolierverfahren hier berichtet wird, auf einem 2-Schritt-Perfusionsverfahren, gefolgt von Reinigung über Dichtegradientenzentrifugation basieren. Die Methode wurde von dem vom Smedsr d et al ursprüngliche Protokoll geändert. 16 für Rattenleberzellisolierung konzipiert. Die meisten Studien berichtet und beschrieben die Isolierung von Kupffer-Zellen aus Rattenlebern. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Kupffer-Zellen aus Mäuseleber isoliert, in hoher Ausbeute und Reinheit. Die Verwendung von Mäusen, vermindert die Kosten und Experiment erlaubt die Verarbeitung mehrerer Lebern, große Mengen von Kupffer-Zellen zur Nanopartikeltoxizitätstests erhalten.
Im folgenden Protokoll wurden Kupffer-Zellen mit funktionalisierten Kohlenstoff-Nanoröhren inkubiert (f </em> -CNTs). Die einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften von CNTs – also hohen Länge-Durchmesser-Verhältnis und eine große Oberfläche haben CNTs interessante Kandidaten als Vektoren für die Therapie und Diagnosezwecken hergestellt. Allerdings wurde die Sorge in Bezug auf die Toxizität von CNTs 19, und die Entwicklung neuer in vitro-Tests zielt darauf ab, das Verständnis der CNT biologische Wirkung erhöht. Toxizität in Kupffer Zelle mit einem Mangel an struktureller Integrität der Zellmembran assoziiert. Dies wird durch den Verlust der zytoplasmatischen Enzyms LDH aus der Zelle in den Überstand gemessen. Das Prinzip dieses Verfahrens ist es daher, um jede freigesetzte LDH zu entfernen und zu messen, was in den Zellen 20 belassen. Dies wird bevorzugt, um die Messung des freigesetzten LDH im Überstand durchgeführt, da das Vorhandensein von CNTs in dem Überstand stört den Test 21.
Wir schlagen vor, die Verwendung dieser einfachen und kostengünstigen Kupffer Zellisolierung method zu hoher Anzahl funktioneller Kupffer-Zellen zu isolieren. Dies ermöglicht das Screening von Toxizität einer Reihe von Nanopartikeln in einem relevanten primären Makrophagenmodell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die folgenden Schritte sind entscheidend für die hohe Ausbeute und hohe Rentabilität der Kupffer-Zellen zu erreichen. Aseptischen Bedingungen zu verwenden, um das Risiko einer bakteriellen und Pilzkontamination zu begrenzen. Alle Instrumente müssen vor Gebrauch sterilisiert werden. Reagenzien werden frisch vor der Durchführung der Isolationsverfahren hergestellt werden.
Die Wahl der Collagenase IV, mit niedrigen Trypsinaktivität, ist von entscheidender Bedeutung. Verschiedene Partien vo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.
Materials
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | – | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll®) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96®) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. | ||
Referencias
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