Kupffer Cell Isolatie Nanoparticle toxiciteit testen

Het gebied van nanotoxicologie onderzoek richt zich op het biologisch effect van nanodeeltjes te karakteriseren. Toxicologische studies op basis van in vivo onderzoek blijven de meest accurate methoden. Echter, is het gebruik beperkt door de kosten, arbeid en tijd eisen ^1. Als alternatief zijn in vitro assays werden gebruikt vanwege hun eenvoud en de mogelijkheid van het ontwikkelen high-throughput in vitro testplatformen ² – zodat uitbreiding van het aantal geteste omstandigheden. De meeste nanotoxicological studies worden uitgevoerd met behulp van in vitro testen met onsterfelijk gemaakte cellijnen. Er zijn echter zorgen over de extrapolatie van deze experimentele bevindingen in vivo toxicologische effecten ^3. Inderdaad kan de eigenschappen van geïmmortaliseerde cellijnen significant van weefsels ze zijn ontleend, bijvoorbeeld genetische transformatie ^4, verslechtering van de belangrijkste morfologische kenmerken te5, het verlies van cellulaire polariteit ⁶ en functionele veranderingen, zoals de regulering van ontstekingsmediatoren ^7.

Kupffer cellen zijn de meest voorkomende macrofaag populatie in het lichaam en die direct in contact met bloed door langs de wand van de lever sinusoïden. Als onderdeel van het reticulo-endotheliale systeem (RES), die macrofagen verantwoordelijk voor het opvangen van circulerende nanodeeltjes en vormen derhalve een zeer geschikt model de toxiciteit van nanodeeltjes te bestuderen. In vivo ⁸ es in vitro studies ⁹ van inflammatoire responsen geassocieerd met Kupffer cellen blootgesteld aan nanodeeltjes elders gepubliceerd. Kupffer cellen zijn ook betrokken bij de pathogenese van leverziekten zoals alcoholische leverziekte ^10, leverfibrose ¹¹ of virale hepatitis ^12. Er werd gemeld dat geïsoleerde Kupffer cellen nuttig inzicht om cellulaire mechanismen inv beschrijvenolved in de lever verstoring ^13,14.

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven voor het isoleren en zuiveren Kupffer cellen. Celisolatie kan ontstaan ​​door mechanische of enzymatische dissociatie ^15. Collagenase spijsvertering toont het voordeel van het behoud van de functionele integriteit van Kupffer cellen, terwijl leidt tot hoge Kupffer celopbrengst ^16. Vele experimentele benaderingen, variërend in complexiteit en kosten, zijn gebruikt om Kupffercellen scheiden van andere levercel populaties. Zo kunnen Kupffer cellen zuiverheid worden bereikt door immunoaffiniteit ^17, stroom ¹⁸ elektroforese, selectieve adhesie ¹⁶ of centrifugale technieken ¹⁶ die cellen te selecteren op basis van hun grootte en dichtheid. Een combinatie van deze methoden kunnen worden gekozen om de zuiverheid van de bevolking ¹⁶ verhogen. Er is geen consensus over de ideale methode voor Kupffer cel isolatie, want het is meestal afhankelijk van de toepassing en de beschikbare uitrustingt. In het geval van toxiciteit nanodeeltjes testen, de eenvoud en hoge opbrengst van de techniek in verband met functionele behoud van Kupffer cellen bleken het meest geschikt voor deze toepassing zijn.

De Kupffer cellen isolatiemethode hier gerapporteerd is gebaseerd op een 2-staps werkwijze perfusie gevolgd door zuivering op dichtheidsgradiënt. De methode werd aangepast van het originele protocol ontwikkeld door Smedsrød et al. ¹⁶ ontworpen voor rattenlever celisolatie. De meeste studies gerapporteerd en beschreven de isolatie van Kupffer cellen uit levers rat. Hierin beschrijven we een werkwijze voor Kupffercellen isoleren uit muizenlever, met een hoge opbrengst en zuiverheid. Het gebruik van muizen reduceert het experiment kosten en maakt de behandeling van verscheidene lever grote hoeveelheden Kupffercellen toxiciteit nanodeeltjes testen te verkrijgen.

In het volgende protocol werden Kupffer cellen geïncubeerd met gefunctionaliseerde koolstof nanobuisjes (f </em> -CNTs). De unieke fysisch-chemische eigenschappen van CNTs – zoals bij hoge lengte tot diameter groot oppervlak hebben CNTs interessante kandidaten die als vectoren voor therapie en diagnose doeleinden. Echter, zijn bezorgdheid geuit over de toxiciteit van CNT ^19, en de ontwikkeling van nieuwe in vitro testen is gericht op het vergroten van het inzicht in de CNT biologisch effect. Toxiciteit in Kupffer-cel is geassocieerd met een gebrek aan structurele integriteit van de celmembraan. Dit wordt gemeten door het verlies van de cytoplasmatische enzym LDH uit de cel in de supernatant. Het principe van deze methode is daarom om vrijgekomen LDH te verwijderen en meten wat overblijft in de cellen ^20. Dit gebeurt in plaats van het meten van de vrijgekomen LDH in de supernatant omdat de aanwezigheid van CNTs in het supernatant interfereert met de test ^21.

Wij stellen voor het gebruik van deze eenvoudige en kosteneffectieve Kupffer celisolatie method hoge aantal functionele Kupffer cellen te isoleren. Hierdoor kan de screening van toxiciteit van verschillende nanodeeltjes, in een relevante primaire macrofaag model.