JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingeniería

Инженерная 3D Шелковый коллагена на основе модели поляризованного нервной ткани

Published: October 23, 2015
doi:
10.3791/52970
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Tufts University, 2Department of Pediatrics,University of Connecticut Health Center & Connecticut Children’s Medical Center

Summary

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Abstract

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Introduction

Центральная нервная система (ЦНС) могут быть затронуты различными нарушениями, связанных с сосудистой, структурные, функциональные, инфекционный или дегенеративный. По оценкам 6,8 млн человек ежегодно умирают в результате неврологических расстройств, что представляет собой растущую социально-экономическое бремя во всем мире 1. Тем не менее, лишь немногие из нарушений есть доступные процедуры. Таким образом, существует острая необходимость в инновационных терапевтических стратегий для пациентов, страдающих от неврологических расстройств. К сожалению, многие ЦНС целевые терапевтические неудачу в ходе клинических испытаний, в частности, из-за использования неадекватных доклинических исследований моделей, которые не позволяют оценить острых и хронических воздействий с физиологически соответствующих функциональных показаний.

Несмотря на значительные усилия исследования в течение последних десятилетий, есть огромное количество неизвестно о структуре и функции ЦНС. Для того, чтобы получить больше знаний, модели животных часто намред модели патологических состояний, таких как травмы головного мозга травматического (TBI) или слабоумия, особенно в доклинических исследованиях. Тем не менее, животные существенно отличаются от людей как в анатомии ЦНС, а также в функции, экспрессии генов и метаболизма 2-4. С другой стороны, 2D культур в пробирке являются распространенным методом для исследования клеточной биологии и которые обычно используются для открытия новых лекарств. Однако культуры клеток 2D хватает сложность и физиологическое значение по сравнению с человеческим мозгом 5-7. Хотя не является заменой для низкой стоимости и простоты 2D исследований на клеточных культурах или сложности, предоставленной на животных моделях, 3D тканевой инженерии может генерировать усовершенствованные исследовательские модели, чтобы закрыть разрыв, который существует между 2D в пробирке и в естественных подходов. 3D тканевой инженерии обеспечивает более физиологически соответствующие экспериментальные условия, достигнутые 3D межклеточных взаимодействий и внеклеточных сигналов, предусмотренных биоматериала лесов. DespITE значительное доказательство за стоимости 3D культур, в настоящее время существует лишь несколько моделей ткани 3D ЦНС, таких как стволовые клетки получены Органоид культур 8-10, neurospheroids 11 и диспергируют гидрогеля культуры 12,13. Перспективные технические методы, включая многослойной литографии 14, и 3D-печати 15 были использованы для изучения легких, печени, почек и ткани. Тем не менее, есть отсутствие моделей 3D ЦНС, которые позволяют на секции роста нейронов, таких как имитируя корковой архитектуру и биологию. Отдельно рост нейритов из нейрональных клеток органов ранее продемонстрировано в 2D культур с помощью микрообработки 16,17 позволяя изучение трассировки аксонов тракта, притока кальция, сетевой архитектуры и деятельности. Эта идея вдохновила нас к разработке 3D поляризованного нервной ткани, где сотовые органы и аксонов массивы, расположенные в разных отсеках имитируя многоуровневую архитектуру мозга 18 </sup>. Наш подход основан на использовании уникального дизайна шелковой лесов который вмещает высокую плотность клеток в ограниченном объеме и позволяет разрастание плотной аксонов сети в коллагеновый гель. Здесь мы демонстрируем полную процедуру сборки головного мозга, как ткани, включая изготовление лесов и нейронов культуры.

Protocol

Протокол изоляции ткани мозга была одобрена Institutional Комитета по уходу и использованию животных Университета Тафтса по и соответствует Национальных Институтов Здоровья Руководства по уходу и использованию лабораторных животных (Institutional Animal Care и использования комитета B2011-45). 1. Подготовка Шелковый леса Подготовка раствора из шелка тутовый шелкопряд коконов, как описано ранее 19,20. Разрежьте каждый кокон на 8 равных частей с помощью ножниц. Используйте около 11 коконов в течение 5 г фрагментированных коконов. (15 мин) Подготовьте 2 л 0,02 М Na 2 CO 3 раствором и довести его до кипения, используя горячую плиту. (15 мин) Взвесьте 5 г фрагментированных коконов и варить их в Na 2 CO 3 раствором в течение 30 мин. Движение кипящей шелковые каждую пару минут с помощью шпателя. Этот шаг, называемый также де-гуммирование, очищает фиброин шелка из гидрофильных белков, sericins. (30 мин) <lя> Отожмите фиброин от руки и промойте его в дистиллированной воде, по крайней мере три раза, чтобы промыть все оставшиеся серицин и химических веществ. (5 мин) Поместите влажный фиброин на чашку Петри и высушить экстракт фиброина в капот потока O / N. На следующий день взвешивают сухой массы фиброина и поместите фиброин в стеклянном стакане. (15 мин) Для того, чтобы растворить фиброин в 9,3 М растворе LiBr, рассчитать необходимый объем (в мл) LiBr путем умножения массы сухого фиброина на 4. Медленно залить LiBr раствора над шелковой фиброина и погружают все фиброина волокон с помощью шпателя. Накройте стакан для предотвращения испарения и поместить его при 60 ° С в течение 4 ч, чтобы позволить волокна, чтобы растворить. (15 мин) Использование шприца, собирать фиброина решение от стакана и загрузить его в MWCO 3500 диализных кассетах. Выполнение диализ против дистиллированной воды в течение 48 ч. Меняйте воду каждые два часа. Использование шприца, собирать фиброина решение откассеты в 50 мл конические пробирки и центрифугируют дважды при 9000 оборотах в минуту (~ 12700 х г) при 4 ° С в течение 20 мин. Налейте надосадочную жидкость в новую пробирку после каждого шага центрифугирования и отбросить гранул. (40 мин) Измерение концентрации фиброина путем оценки сухого веса. Залить 1 мл раствора шелка в весовой лодке. Сушат образца в печи при 60 ° С в течение 2 ч. Взвесить сухой фиброин шелка и расчета концентрации шелка фиброина раствора путем умножения полученного вес 100. ожидаемую концентрационную шелка раствора 6-9% (вес / объем). Регулировка концентрации шелка до 6% (вес / объем) разбавлением дистиллированной водой. Остановка точка: жидкость шелк фиброина можно хранить при 4 ° С в течение одного месяца в закрытом контейнере. Подготовка пористых каркасов из шелка решения. Сито гранулированного NaCl, чтобы отделить гранулы размером 500-600 мкм, который будет использоваться на последующих этапах. Откажитесь от гранулс размером менее 500 мкм и выше 600 мкм. (15 мин) Налейте 30 мл 6% раствора шелка в политетрафторэтилена (ПТФЭ) формы (Рисунок 1). Аккуратно рассеивают 60 г просеянной NaCl над шелка. Нажмите контейнер, чтобы получить однородный слой соли. Инкубируют 48 ч при комнатной температуре для полимеризации шелк. Поместите строительных лесов, содержащего ПТФЭ форму в печи при 60 ° С в течение 1 часа, чтобы завершить полимеризацию и испарить оставшуюся жидкость. Поместите содержание ПТФЭ плесени в химический стакан, содержащий 2 л дистиллированной воды в течение 48 ч, чтобы выщелачивание соли. Менять воду 2-3 раза в день. Извлеките губку каркасов из форм, когда соль полностью вымывается точки остановки:. Губки могут быть сохранены погружают в воду при 4 ° С в закрытом контейнере, чтобы предотвратить каркасов от обезвоживания. Когда все будет готово, вырезать подмости с 5 мм диаметром биопсии удар. Нарезанные каркасов для достижения около 2 мм в высоту. ПуNCH ​​из центра на эшафот с 2 мм биопсии удар диаметр (рис 2А). (1 час) Автоклав каркасов погружают в воду, чтобы стерилизовать их (мокрый цикл, 121 ° C, 20 минут) Остановка точку:. Губки могут быть сохранены погружают в воду при 4 ° С в закрытом контейнере, чтобы предотвратить каркасов от обезвоживания. Перед запланированной посева клеток, погружают каркасов в стерильной 0,1 мг / мл поли-D-лизином раствора (PDL). Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С. Промыть 3 раза каркасы с фосфатным буферным раствором (PBS), чтобы удалить не связанный PDL. (30 мин) 2. Выделение Крыса корковых нейронов Проанализируйте кору из эмбриональных день 18 (E18) Спрэг Dawley крыс, как описано ранее Пачифичи и Перуцци 27 после утвержденного протокола животное получается. (2 ч) Инкубируют 10 кору в 5 мл 0,25% трипсина с 0,3% ДНКазы I (от поджелудочной железы быка) в течение 20 мин при 37 ° С. Инактивации трипсина, добавив равный объем 1 мг / мл соевого белка. Растирают кору, используя 10 мл пипетки Пастера от пипетки вверх и вниз 20 раз, пока один клеточной суспензии не генерируется. Будьте нежны и избежать образования пузырьков воздуха. (10 мин) Центрифуга клеточной суспензии в 127 мкг в течение 5 мин. Повторное приостановить осадок клеток в 10 мл культуральной среды (Neurobasal среднего, 1x B27 добавки, 1x Glutamax, 1% пенициллина / стрептомицина). Граф клеток. Ожидаемый концентрации клеток примерно 2х10 7 / мл. (20 мин) 3. Построить Ассамблею и культура Леса посев с клетками. Перемещение стерильные каркасов и все необходимые столовые приборы внутри капот культуре клеток. Использование стерильного пинцета поместить каркасы в клеточной культуре 96-луночного планшета выделении одного каркас на лунку. (10 мин) Погрузитесь каркасов в среде для культивирования клеток, чтобы уравновесить их до клеток семениIng. Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С. (10 мин) Аспирируйте избыток среды от лесов. Применить 100 мкл клеточной суспензии / эшафот. (10 мин) Инкубируйте клетки при 37 ° CO / N, чтобы для прикрепления клеток к плахе. На следующее утро аспирации непривязанными клетки и применить 200 мкл / лунку свежую культуральную среду. (10 мин) Строительные леса встраивания с коллагеновой матрицы. (2 ч) Поместите 10x PBS, водой, 1 N NaOH и хвоста крысы коллагена на льду. Подготовка рабочего раствора коллагена в соответствии с инструкциями производителя. Поддержание на льду до конструкты клеток-затравку не готовы (до 1 ч). Удалить клеточные семенами шелковые конструкции из инкубатора и аспирата избыток среды. Использование стерильного пинцета передачи каркасов на пустые лунки на пластину погружают а каждый и каркас в 100 мкл 3 мг / мл раствора коллагена. Поместите планшета для культуры ткани обратнов инкубаторе в течение 30 мин, чтобы позволить полимеризации коллагена. Применить 100 мкл подогретого клеточной культуральной среды / лунку. Культура конструкты в течение одной недели замены среды ежедневно путем замены только половину объема среды. 4. Анализ микроскопии Live / мертвых окрашивания (1 час) Подготовка исходного раствора пропидийиодидом (PI) 1 мг / мл (1,5 мМ) в дистиллированной воде. Подготовка исходного раствора флуоресцеина диацетата (FDA) 2 мг / мл в ацетоне. Подготовить рабочий раствор, содержащий 10 мкМ PI и 0,15 мкМ FDA разбавленный в PBS. Предварительно нагреть раствор до 37 ° С на водяной бане. Вымойте клеток с подогретого PBS, чтобы удалить сывороточные эстеразы. Аспирируйте PBS. Нанесите подогретого рабочего раствора на клетки в течение 2 мин и промойте его PBS. Используйте эпифлуоресцентной микроскопа изображение клетки (ПИ экс λ = 490 нм, λ = EM 570 нм; FDA экс Л = 490 Нм, ет λ = 514 нм). Пятно остается стабильным в течение 40 мин. Длительное окрашивание может привести к неспецифической окрашивания в результате поглощения PI клетками и со-локализации ИП / FDA в клетках. Иммуноокрашивание В заданное время точки культуры фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида (PFA) в течение 30 мин при комнатной температуре. Из-за токсичности PFA дымит шаг крепления должны быть выполнены в химической вытяжкой. Промыть каркасов с 3x PBS точки остановки:. ПФА-фиксированные конструкции могут быть сохранены в PBS при 4 ° С в течение нескольких дней, прежде чем приступить дальнейших шагов. Инкубируйте каркасов в 0,2% Triton, 0,25% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS, содержащие первичное антитело O / N при 4 ° С. На следующий день отказаться от окрашивания раствор и промыть Леса 3 х 30 мин с PBS для удаления несвязанного первичного антитела. Инкубируйте образцы с вторичным антителом, разведенным в 0,2% Тритон, 0,25% BSA в PBS в течение 2ч при комнатной температуре. Удалить окрашивания раствор и промыть Леса 3 х 30 мин с PBS для удаления несвязанного вторичного антитела. Изображение каркасы, использующие конфокальной микроскопии с 20X цели, принимая 100 мкм Z-секции образца с 1 мкм шагом. Для визуализации тонких нейриты разрешение изображения должно быть минимальной 1,024 х 1,024 пикселей. РНК, ДНК и белка изоляция Примечание: РНК, ДНК и выделение протеина, использу коммерческий AllPrep ДНК / РНК / белок Mini Kit в соответствии с инструкциями производителя. Использование стерильного пинцета передачи каркасов из культурального планшета в 2 мл стерильной пробирке. Разместите один эшафот за трубку. Добавить 200 мкл буфера RLT в каждую пробирку. Лишить конструкцию фрагментируя его стерильными microscissors. Для гомогенизации нарушенную ткань, передавать содержимое тубы на ротационную колонку. Спин в течение 2 мин на полной скорости в микроцентрифуге.Лизат гомогенизируют, как она проходит через ротационную колонку. Собирают поток через и использовать его немедленно выделения РНК, ДНК и белка в соответствии с протоколом производителя. Количественно выход нуклеиновых кислот любой другой совместимый метод (например, NanoDrop). Количественная выход белка, используя BCA анализа белка в соответствии с инструкциями изготовителя. Измерьте результаты анализа с помощью планшетного на длине волны 562 нм. Примечание: Ожидаемый выход нуклеиновых кислот и белка в конструкции по отношению к плотности клеток, показан на рисунке 4.

Representative Results

Твердые шелковые губки нарезанные по форме пончика, представляют собой уникальную и простую идею, чтобы достичь разобщенным архитектуру, напоминающую нервной ткани (рис 2а). Высоко пористая структура помост с размером пор 500 мкм приводит к исключительно высокой площадью поверхности, позволяющих посев и рост высокой плотности клеток в малом объеме (2×10 7 / мл) (2В). Кроме того, высокая пористость эшафот позволяет для неограниченного распространения питательных веществ и отходов, образующихся в превосходной жизнеспособности плотных клеточных культур в течение длительного времени кадров. После посева нейроны быстро и равномерно прикрепить к поверхности каркасных порах. После прикрепления клеток является полным и клетки уравновешивали в шелковой подложке, губка каркас заполняется мягкой коллагеновой матрицы, чтобы обеспечить среду для 3D аксонов формирования сети (рис 3 </strong>). При отсутствии в коллагеновой матрице Компартментализация аксонов и клеточных тел невозможно, так как нейроны растут расширения только на поверхности пор в результате смешанных сетей, как обнаружено с 2D поверхностей (фигура 3В). В противоположность этому, коллагеновый гель обеспечивает сетчатую структуру, которая поддерживает обширный аксонный отросток в 3D, а нейронные клеточные тела остаются прикрепленными к шелковой помост (рис 3C). Эта модель роста приводит к разобщенности клеток органов и чистых аксонов сетей (рис 3D), который напоминает серого и белого вещества коры головного мозга. Помимо микроскопии, конструкции могут быть оценены с различными другими методами 18, в зависимости от вопроса за эксперимента. Например, выделение ДНК, РНК и белка из конструкций может быть легко выполнена с использованием коммерческих наборов (рисунок 4). Выход нуклеиновых кислот и белков PEг конструкция зависит от количества клеток изначально посеянных на шелковых каркасов. Чем больше клеток высевали тем выше выход ДНК, РНК и белка. Рисунок 1. ПТФЭ формы используются для приготовления шелк губка лесов Размеры:.. 10 см в диаметре, 2 см высота Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. 3D мозга, как модель ткани. (А) пористого шелк губка эшафот. (Б) Live / мертвых окрашивания нейронов в 1 день на посев на шелковой эшафот, прежде чем коллаген встраивания (зеленый-живых клеток, красных мертвые клетки). Панели на правой стороне показать маgnification площади захваченного в красных рамках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3. нейронов разобщенным вырост в 3D-модели мозга, как ткани (A) Леса отсеков:. Кузовом купе красных клеток, Blue-купе аксонов. (Б) нейронов модель роста в 1-й день после посева до коллагена вложения. (С). Нейронов вырост на 7 день после посева в теле клетки отсека. (D) нейронов вырост на 7 день после посева в аксонов отсеке. Зеленый -. ΒIIITubulin Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этогофигура. Рисунок 4. Ожидаемые выход (A) РНК и ДНК, и (б) белка в конструкции по отношению к количеству клеток, посеянных на эшафот (± SD, п = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,

Discussion

Here we described the guidelines to assemble a compartmentalized 3D brain-like tissue model. The model is characterized by dense polarized culture of neurons resulting in the development of two morphologically different compartments: one containing densely packed cell bodies, second containing pure axonal networks. Overall, the scaffold architecture and growth pattern mimic brain cortical tissue including the six laminar layers and white matter tracts21.

The donut-shaped silk protein-based tissue model allows for modifications and tuning of mechanical properties, versatile structural forms, hydrogel fillers and cellular components. Thus, this tissue model establishes a base platform for a wide range of studies. Silk is a favorable candidate for biomaterial platforms due to its biocompatibility, aqueous-based processing, and robust mechanical and degradation properties22. The silk matrix also serves as a stable anchor to reduce collagen gel contraction over time in culture. The properties such as silk concentration and porosity of the scaffold used in this model have been previously adjusted to achieve optimal cell growth and mechanical properties resulting in brain-like tissue elasticity18,23,24. We suggest to keep these parameters constant to ensure the successful outcome and reproducibility of the experiments.

The 3D neuronal network formation was achieved by combining two types of biomaterials with different mechanical properties: a stiff scaffold to provide neuronal anchoring and a softer gel matrix to permit axon penetration and connectivity in 3D. Selective material preferences of the silk scaffold and soft hydrogel provide the underlying principle for compartmentalizing the neurons from the axonal connections. Due to the inert nature of the silk scaffold, functionalization with poly-D-lysine is required for neuronal attachment. However, other cell adhesion promoting factors can be applied such as RGD25 or fibronectin26. To achieve the 3D network formation the silk scaffold needs to be filled with hydrogel in a timely manner as soon as neurons are attached to the scaffold. Likewise, the collagen matrix filler can be replaced by other hydrogels, thus allowing the study of the influence of 3D extracellular environments on axonal network formation to serve as a platform to evaluate novel hydrogels in terms of neuronal compatibility. Additionally, apart from rat cortical neurons other neuronal sources such as hippocampal neurons or induced pluripotent cell (iPSc)-derived neurons can be utilized. Moreover, the tissue model can be used to study heterocellular interactions by including glial cells along with neurons and to build more complex brain-like tissue.

As shown previously, our model can be utilized to evaluate neuronal functionality in 3D microenvironment with a variety of assays such as cell viability, gene expression, LC-MS/MS and electrophysiology, thus demonstrating physiological relevance of the model18. Other methods, which are frequently utilized to evaluate 3D tissue-engineered constructs, such as immunostaining and microscopy8,9,11 can also be used to assess cell distribution and extent of axonal network formation. However, it has to be noted, that due to the high density of the collagen matrix, the penetration of antibodies and depth of the imaging is limited to few hundred micrometers. Moreover, the signal to noise ratio may be affected by nonspecific background fluorescence. This can be overcome by using lipophilic cell tracers and genetically expressed fluorescent proteins which diminish the need for immunostaining11. Alternatively, the imaging can be performed with 2-photon microscopy instead of usual one-photon technique, which may reduce the signal loss, photobleaching, and can be extended to several hundred micrometers of depth.

Summarizing, the silk and collagen-based brain-like tissue offers a robust platform to study neuronal networks in 3D and is a starting point for the development of more advanced models of neurological disorders in the future. Independent from the mode of evaluation, the relative simplicity of this tissue model supports its utility, success and reproducibility.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the laboratory of Dr. Stephen Moss for providing embryonic rat brain tissues. M.D.T. designed the original protocol. This work was funded by National Institutes of Health P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520. K.C. was supported with Postdoctoral Fellowship from German Research Foundation (DFG) (CH 1400/2-1).

Materials

Na2CO3 Sigma-Aldrich 223530 –
LiBr Sigma-Aldrich 213225 –
MWCO 3500 dialysis cassettes  Thermo Fisher 66110 –
Heating plate Fisher Scientific Isotemp –
Centrifuge 5804 R Eppendorf – –
Sieve Fisher Scientific – No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold – – made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl Sigma-Aldrich 71382 –
Biopsy Punch 5mm World Precision Instrument 501909 –
Biopsy Punch 2mm World Precision Instrument 501908 –
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-5MG final concentration 10 ug/ml, dissolved in water
PBS Sigma-Aldrich D1283-500ML –
Trypsin Sigma-Aldrich T4049-500ML –
DNase Roche 10104159001 final concentration 0.3%
Soybean protein Sigma-Aldrich T6522-100MG final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium Gibco 21103049 warm up to 37°C before use
B27 supplement 50x Gibco 17504-044 –
Glutamax Gibco 35050-061 –
Penicilin Streptomycin Corning 30-002-CI –
Collagen I, rat tail, 100 mg Corning 354236 final concentration 3 mg/ml
NaOH Sigma-Aldrich S2770 corrosive
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4170-10MG toxic
Fluorescein Diacetate Sigma-Aldrich F7378-5G –
Olympus MVX10 Olympus – –
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-10G –
anti-βIIITubulin antibody  Sigma-Aldrich T2200 rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546 Molecular Probes A11010 goat 1:250
goat serum Sigma-Aldrich G9023-5ML –
Leica SP2 confocal microscope Leica – objective 20x
QIAshredder Qiagen 79654 –
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit Qiagen 80004 –
Ethyl alcohol, Pure Sigma-Aldrich E7023  –
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich 63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific – –
BCA protein assay Thermo Scientific 23225 –
Plate reader Spectramax M2 Molecular Devices – absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type TedPella 1346 –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. Chapter 1, Public health principles and neurological disorders. Neurological Disorders. , (2005).
  2. Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics. Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).
  3. Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).
  4. Wesseling, H., et al. A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).
  5. Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures. Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).
  6. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  7. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  8. Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).
  9. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  10. Hogberg, H. T., et al. Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. Stem Cell Res Ther. 4, S4 (2013).
  11. Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly. Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).
  12. Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel. Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).
  13. Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells. Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).
  14. Gurkan, U. A., et al. et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures. Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).
  15. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).
  16. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature. 2 (8), 599-605 (2005).
  17. Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity. J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).
  18. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).
  19. Rockwood, D. N., Preda, R. C., Yücel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).
  20. Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).
  21. Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts. Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).
  22. Vepari, C., Kaplan, D. L. Silk as a biomaterial. Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).
  23. Yao, D., et al. Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).
  24. Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).
  25. Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering. Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).
  26. Hopkins, A. M., et al. Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering. Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).
  27. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol. Vis. Exp. (63), e3965 (2012).

Tags

Silk-collagenPolarized NeuronsBrain-derived NeuronsNeural NetworkAxonal GuidanceCell-cell InteractionCell-matrix InteractionElectrical Function

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Chwalek, K., Sood, D., Cantley, W. L., White, J. D., Tang-Schomer, M., Kaplan, D. L. Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue. J. Vis. Exp. (104), e52970, doi:10.3791/52970 (2015).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image