偏神経組織のエンジニア3Dシルクコラーゲンベースモデル

脳組織の分離プロトコルは、タフツ大学施設内動物管理使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する健康ガイド（施設内動物管理使用委員会B2011-45）の国立研究所に準拠していました。 1.シルク足場の準備 カイコの繭からシルク溶液の調製以前に19,20説明したように。 はさみを使用して8等分に各繭をカットします。断片化された繭の5グラム約11繭を使用してください。 （15分） 0.02 MのNa 2 CO 3溶液の2リットルを用意し、ホットプレートを用いて沸騰するためにそれを持って来ます。 （15分） 断片化された繭を5g秤量し、30分間のNa 2 CO 3溶液でそれらを沸騰。スパチュラで沸騰絹を数分おきにかき混ぜます。また、脱ガム引きと呼ばれるこのステップは、親水性タンパク質、セリシンから絹フィブロインを浄化します。 （30分） <li>は、手でフィブロインを強く絞りと、残りのセリシンや化学物質を洗い流すために、蒸留水で少なくとも3回、それをすすいでください。 （5分） シャーレに湿ったフィブロインを置き、流フードO / Nでフィブロインの抽出物を乾燥させます。 次の日は、乾燥フィブロイン量を計量し、ガラスビーカー中フィブロインを配置します。 （15分） 9.3 MのLiBr溶液にフィブロインを溶解させるために、4で乾燥したフィブロインの質量を乗じてのLiBr（ml単位）必要な量を計算ゆっくり絹フィブロインを超える臭化リチウム水溶液を注ぎ、スパチュラを使用して、すべてのフィブロイン繊維を浸します。蒸発を防止し、繊維を溶解させるために4時間60°Cでそれを配置するビーカーを覆います。 （15分） シリンジを用いて、ビーカーからフィブロイン溶液を収集し、MWCO 3500透析カセットにロードします。 48時間蒸留水に対して透析を行ってください。水に数時間おきに変更します。 シリンジを使用して、よりフィブロイン溶液を集めます20分間4℃で9,000 rpmで（〜12,700 XG）の2倍で50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にカセット。各遠心分離工程の後に新しいチューブに上清を注ぎ、ペレットを捨てます。 （40分） 乾燥重量を推定することによりフィブロインの濃度を測定します。計量ボートに絹溶液1mlを注ぎます。 2時間60℃のオーブン中でサンプルを乾燥させます。乾燥した絹フィブロインを秤量し、シルク溶液の予想濃度が6-9％（w / v）のある100により得られた重みを乗算して絹フィブロイン溶液の濃度を計算します。 蒸留水で希釈することにより（w / v）の6％絹濃度を調整します。 停止ポイント液体絹フィブロインは、密閉容器内で最大1ヶ月間、4℃で保存することができます。 シルク溶液から多孔質足場の調製。 顆粒を分離するために、粒状のNaClをふるいは、後のステップで使用される500-600μmで、大きさ。顆粒を破棄Sは500ミクロン以下および600ミクロンを超えるサイズに。 （15分） ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）型（ 図1）への6％絹溶液30mlを注ぎます。静かに絹の上にふるいにかけられ、NaClの60グラムを散乱。塩の均一な層を得るために、コンテナをタップします。絹の重合に室温で48時間インキュベートします。 重合を完了し、残りの液体を蒸発させるために1時間60℃のオーブンで足場を有するPTFE製の金型を置きます。 塩を浸出するために48時間蒸留水2リットルを含むビーカー中のPTFE金型のコンテンツを配置します。水1日あたり2〜3回に変更します。塩が完全に溶出されたときに、金型からのスポンジ足場を削除ポイントの停止 ：スポンジ脱水から足場を防ぐために密閉容器中で4℃の水に浸漬し保存することができます。 準備ができたら、直径5mmの生検パンチで足場を切り出します。高さが約2mmに到達するために足場をプレカット。 Puの直径2mmの生検パンチ（ 図2A）で足場の中心をNCH。 （1時間） 。 ポイントの停止 （湿潤サイクル、121℃、20分）して滅菌水に浸漬した足場をオートクレーブ：スポンジ脱水から足場を防ぐために密閉容器中で4℃の水に浸漬し保存することができます。 計画された細胞播種の前に、滅菌した0.1 mg / mlのポリ-D-リジン（PDL）溶液中で足場を浸します。 37℃で1時間インキュベートします。 足場は非結合PDLを除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄します。 （30分） ラット皮質ニューロンの2の単離承認された動物プロトコルが得られた後、以前にPacificiとペルッツィ27で説明したように日胚から18（E18）Sprague-Dawleyラットを皮質を解剖。 （2時間） 3で20分間（ウシ膵臓から）、0.3％のDNアーゼIを有する0.25％トリプシン5mlの10皮質をインキュベート7°C。 1mg / mlの大豆タンパク質の等容積を添加することによってトリプシンを不活性化します。 単一細胞懸濁液が生成されるまでピペットで10 mlのパスツールピペットを用いて皮質ダウン20回粉砕します。穏やかであると気泡の形成を避けます。 （10分） 5分間127×gで細胞懸濁液を遠心。 再懸濁培地10ml中の細胞ペレット（Neurobasal培地、1×B27サプリメント、1×グルタマックス、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。細胞を数えます。予想される細胞濃度が約2×10 7 / mlです。 （20分） 3.アセンブリと文化を構築細胞と足場播種。 無菌の足場と細胞培養フード内のすべての必要な調理器具を移動します。滅菌ピンセットを使用して、ウェルごとに足場を割り当てる、96ウェル細胞培養プレート中で足場を置きます。 （10分） 前の細胞種にそれらを平衡化するために、細胞培養培地中での足場を浸しる。 37℃で1時間インキュベートします。 （10分） 足場からのメディアの過剰を吸引します。 細胞懸濁液/足場の100μLを適用します。 （10分） 足場への細胞接着を可能にするために37°のCO / Nで細胞をインキュベートします。 翌朝は、非付着細胞を吸引し、200μl/ウェルの新鮮な培養培地を適用します。 （10分） コラーゲンマトリックスに埋め込む足場。 （2時間） 私は氷の上にコラーゲン10倍PBS、水、1NのNaOHおよびラットの尾を置きます。製造者の指示に従って、コラーゲンのワーキング溶液を調製します。細胞を播種した構築物は、（1時間まで）準備ができるまで、氷上に維持します。 インキュベーターから細胞を播種した絹の構造を削除し、メディアの過剰を吸引。 滅菌ピンセットを使用すると、ウェルプレートの空のウェルに足場を転送し、3 mg / mlのコラーゲン溶液の100μlの各足場を浸します。バック組織培養プレートを置きコラーゲンの重合を可能にするために30分間インキュベーターインチウェル/予熱した細胞培養培地100μlを適用します。文化一週間構築物は、培地の半分だけボリュームを交換することにより、毎日培地を交換すること。 4.顕微鏡分析生/死染色（1時間） ヨウ化プロピジウム（PI）を蒸留水に1mg / mlの（1.5ミリモル）のストック溶液を調製します。 アセトン中のフルオレセインジアセテート（FDA）の2mg / mlのストック溶液を調製します。 PBSで希釈した10μMのPIおよび0.15μM、FDAを含むワーキング溶液を調製します。水浴中で37℃に溶液を予め温めます。 血清エステラーゼを除去するために、予め温めておいたPBSで細胞を洗浄。 PBSを吸引除去します。 2分間細胞に予め温めておいた作業溶液を適用し、PBSで洗ってください。 FDAの元λ= 490 nは、画像への落射蛍光顕微鏡を使用する細胞（PIの元λ= 490 nmのは、EMλは570nmでの=mは、全角λ）は514nmのを=。染色は、40分かけて安定しています。長時間の染色は、細胞と細胞内でのPI / FDAの共局在によってPI取り込みに起因する非特異的な染色をもたらす可能性があります。 免疫染色培養物の所望の時点で、RTで30分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定します。 PFAの毒性に定着工程は、化学ヒュームフード内で行われるべきであるヒューム。 。 ポイントの停止 3倍PBSで足場を洗う：PFA-固定構築物は、さらなるステップに進む前に数日間4℃でPBS中に保存することができます。 4℃で一次抗体のO / Nを含有するPBS中の0.2％トリトン、0.25％ウシ血清アルブミン（BSA）中で足場をインキュベートします。 次の日は、染色溶液を廃棄し、結合していない一次抗体を除去するためにPBSで足場を3×3​​0分を洗います。 0.2％トリトン中に希釈した二次抗体とサンプル、PBS中の0.25％BSAで2インキュベートRTで時間。 染色溶液を除去し、未結合の二次抗体を除去し、PBSで足場を3×3​​0分を洗います。 画像1μmのステップとサンプルの100μmのZ-セクションを取ることによって20Xの目的とした共焦点顕微鏡を用いて足場。細い神経突起を可視化するために画像の解像度は、最小1,024×1024ピクセルでなければなりません。 RNA、DNAおよびタンパク質の単離注：RNA、DNAおよびタンパク質の分離は、製造業者の説明書に従って商業AllPrep DNA / RNA /タンパク質ミニキットを用いて行われます。 滅菌ピンセットを使用すると、2ミリリットル滅菌チューブに培養プレートの外に足場を転送します。チューブあたり1足場を置きます。 各チューブにRLT緩衝液200μlを追加します。 滅菌microscissorsでそれを断片化することによって構造物を破砕。 破壊された組織を均質化するために、スピンカラムにチューブの内容を転送します。微量でフルスピードで2分間スピン。これは、スピンカラムを通過する際に溶解物を均質化します。 フロースルーを収集し、製造業者のプロトコルに従ってRNA、DNAおよびタンパク質を単離するために、すぐにそれを使用しています。 核酸の収量互換性のある他の方法（例えば、光度計）を定量化します。 製造業者の指示に従ってBCAタンパク質アッセイを使用して、タンパク質収量を定量化。波長562nmでマイクロプレートリーダーを用いたアッセイの結果を測定します。 注：細胞密度に関連して構築あたりの核酸およびタンパク質の予想収量は、 図4に示されています。