Quantificação de citosólico vs vacuolar<em> Salmonella</em> Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial

Agentes patogénicos bacterianos intracelulares replicar quer directamente no citosol da célula hospedeira, ou em compartimentos vacuolares especializados ^1. Durante a fase inicial da infecção a maioria dos patógenos são internalizadas por fagocitose ou por células especializadas (tais como macrófagos) ou por promover activamente a sua própria absorção em células não fagocíticas. Em células fagocíticas, o fagossoma funde normalmente com lisossomas para formar um compartimento de degradação, em que as partículas são digeridas fagocitados. Bactérias citosólicas especializados, tais como Francisella novicida ou Shigella flexneri, escapar degradação phagosomal por induzir a ruptura do fagossoma e subsequentemente escapar para o citosol ^2,3. Isso requer associada a virulência mecanismo como a ilha de patogenicidade Francisella (FPI) ou a Shigella flexneri T3SS, que injeta proteínas efetoras que promovem a ruptura vacuolar ^2-4. As características citosol da célula hospedeiraum número de receptores de reconhecimento de padrões conservados que normalmente reconhecem a presença de patógenos e induzem imune inata sinalização ^5. Além disso, xenophagy, uma forma anti-microbiana de autofagia pode degradar bactérias que entram no citosol. Citossólicos bactérias são normalmente bem adaptado para diminuir ou burlar estas respostas usando estratégias diferentes. Por exemplo, Francisella modifica suas LPS para evitar o reconhecimento de acolhimento e Shigella impede recrutamento autofagia utilizando proteínas efetoras secretadas ^6,7.

Outra estratégia para escapar degradação lisossomal é empregado pelo modelo vacuolar patógeno Salmonella enterica sorotipo Typhimurium, a seguir referido como Salmonella typhimurium. Salmonella usa um T3SS para injetar effectors que remodelar o phagosome inicial em seu nicho intracelular, a Salmonella -contendo vacúolo (SCV) ^8,9. Manipulação contínua de vias de acolhimento énecessária para manter este vacúolo recrutando lípidos e outros nutrientes para o vacúolo. De facto, um mutante de Salmonella sifa falha para manter a estabilidade vacuolar, e entra no citosol das células hospedeiras em questão de horas após a infecção, o que resulta na activação de vias imunes inatas e recrutamento autofagia ^8. Fuga vacuolar de Salmonella varia dependendo do tipo de célula que é estudos, e vários relatórios demonstraram que em células epiteliais mesmo WT Salmonella pode escapar do VCE e hyperreplicate no citosol ^10. Relatórios recentes mostram que a detecção de agentes patogénicos imune inata vacuolares também depende da capacidade do hospedeiro em reconhecer e desestabilizar vacúolos contendo agentes patogénicos PCVs ^(11-14).

Dado que tanto o hospedeiro ou bactérias genótipo pode afectar a distribuição de bactérias intracelulares entre o vacuolar e compartimento citosólico, é necessário para quantificar o número de vacuolar vs.bactérias citosólicas. Uma vez que, em configurações experimentais mais células hospedeiras são infectados com mais do que uma bactéria e, subsequentemente, pode abrigar várias bactérias em diferentes compartimentos subcelulares, uma técnica é necessário que permite a quantificação do nível de bactérias individuais. Permeabilização diferencial (também conhecido como teste de protecção phagosomal) fornece essa resolução ^2,4,10,12. O ensaio é baseado na permeabilização selectiva da membrana plasmática da célula hospedeira com o detergente digitonina, o qual deixa intacta membranas vacuolares e, assim, permite que a coloração selectiva de bactérias citosólicas com anticorpos. Aqui nós fornecemos dois protocolos para a quantificação de cytosolic e vacuolar Salmonella typhimurium usando diferencial permeabilização. O princípio deste método é descrita na Figura 1: macrófagos da medula óssea derivadas (BMDMs) são infectadas com fase estacionária mCherry-expressando Salmonella. Fase estacionária Salmonella precisa tO ser utilizados porque regular negativamente a expressão do SPI-1 T3SS, cuja actividade de outro modo seriam reconhecidos pelo inflammasome NLRC4 e induzir a morte celular rápida (pyroptosis) do BMDMs ^15. Após a infecção as células são lavadas e tratadas com 50 ug / ml de digitonina para 1 minuto. As células são lavadas mais uma vez e imediatamente incubadas com anticorpos anti- Salmonella acoplado a FITC para marcar as bactérias com o acesso ao citosol. Após um passo de lavagem adicional células são lisadas e a percentagem das bactérias mCherry + (vacuolar) e FITC + / + mCherry (citosólica) é determinada por FACS. Nós também relatam uma adaptação deste método que pode ser utilizado se não há estirpes que expressam proteínas fluorescentes estão disponíveis (Figura 2). Os passos adicionais são introduzidas após a marcação com FITC, em que as células são fixadas e permeabilizadas completamente. Posteriormente, todas as bactérias são coradas com anticorpos anti-Salmonella e anticorpos secundários correspondentes. Detec ç ã o é em seguida feito por microscopia, em vez de análise de FACS.