JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología del desarrollo

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

Published: July 30, 2015
doi:
10.3791/52943
, ,
1Department of Biological Sciences,University of Notre Dame

Summary

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Abstract

Zebra balığı gelişimsel biyoloji ve hastalığın çalışma için değerli bir genetik model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Balığı insanlar dahil olmak üzere, diğer omurgalıların, hücresel, moleküler, fizyolojik süreçlerde yüksek genomik koruma derecesinin yanı sıra, benzerlikleri vardır. Erken ontogeny sırasında, Zebra balığı embriyolar araştırmacılar, basit bir stereomikroskop kullanılarak organogenez dinamiklerini görselleştirmek için izin optik şeffaftır. Microbead implantasyonu, yerel ortamlarında faktörlerin değiştirilmesi yoluyla doku manipülasyonu sağlayan bir yöntemdir. Bu araştırmacılar, gelişmekte olan embriyonun içindeki spesifik uzaysal ve zamansal noktada salgılanmış peptidler gibi ilgi konusu sinyal molekülleri, herhangi bir sayıda etkilerini tahlil sağlar. Burada, biz detay erken zebrabalıkları gelişimi sırasında manipüle ve implant boncuklar nasıl bir protokol.

Introduction

Gelişim biyolojisi araştırmacılar, bir organizmanın nasıl oluştuğunu kontrol eden mekanizmaları ortaya çıkarmak için, hücresel, moleküler ve genetik yöntemlerle geniş bir dizi kullanmaktadır. Bu yaklaşımlar arasında, doku manipülasyonu hücre kaderi, hücresel hareketi ve dokuların organizasyonu konusunda karmaşık soruları çözmekte önemli bir araçtır. Lokal doku ortamları değiştirmek için bir yolu, protein ya da diğer sinyal molekülleri 1 odak kaynağı sağlamak için kullanılan mikro-cerrahi uygulanması yoluyla. Deneysel manipülasyon Bu tip yaygın tür kurbağa ve civciv 2 gibi klasik omurgalı embriyoloji modelleri, uygulamaya konmuştur.

Zebra balığı organogenez çalışma için önemli bir omurgalı bir model organizma haline ve insanlarda 6 yüksek genetik koruma payı olarak da hastalık modelleme 3-5 birçok benzersiz avantajlar sağlamaktadır etti. Özellikle, optik saydamlık ve eskiZebra balığı embriyonun gelişim modu, harici doku ontogeny 3-5 gözlem için eşsiz bir bakış açısı sunuyor. Büyük ölçekli ileri genetik ekranlar uygulanması daha fazla çalışma 7,8 ve verimli bir şekilde tek bir laboratuarlarda 9,10 azaltılmış ölçekte gerçekleştirilebilir Alternatif tarama teknikleri tanımlanması için zebra balığı mutant güçlü bir depo üretti. Daha fazla zebrabalıkları ile deneysel çalışmalar transgenik metodolojiler gelişmelere yoluyla kolaylaştırılabilir ve genetik yaklaşımlar 11,12 yanı sıra kimyasal genetik 13-15 tersine olmuştur.

Bu tür mikro uygulanması gibi doku manipülasyon teknikleri yaygın zebrafish istihdam olarak, ama yine de daha da geliştirilmesi sırasında hücre sinyallerini anlamak için yararlı bir araç sağlamak değil. Microbead implantasyon zebra balığı retinada organ oluşumu süreçlerini sorgulamak için kullanılmıştır16,17 kalp 18, beyin 19-22, nöral krest 23 ve 24,25 fin. Bu ve diğer çalışmalarda, boncuk geçişlerini hücre göçü 27 ve eksenel desenlendirme 28 nasıl etkilediğini sinyal molekülleri 26 difüzyonunu anlamak için gelişim sırasında uygulanmıştır. Daha yakın zamanda, mikro-zebra balığı yetişkin 29 yenilenmesi mekanizmaları değerlendirmek için kullanılmıştır. Gelişimsel çalışmalarda, örneğin, Zebra balığı microbead çalışmaları göğüs yüzgeci 25 çalışmalarla bacak oluşum mekanizmalarına anlayışlar sağladı. Zebra balığı göğüs yüzgeci tomurcuk fare, 30 ve civciv 31'inde ön ayakları tomurcuk homolog olduğunu. Omurgalı bacak tomurcuk iki temel sinyal düğümleri vardır: kutuplaştırıcı aktivite Sonic dikenli ifadesi ile ön-to-arka eksen kurar (ZPA) (Shh) ve mansap Hox gen hedeflerinin bölge,ve fibroblast büyüme faktörünün ekspresyonu (FGF'ler) vasıtasıyla kolun distal kimliğine proksimal kurmak için hareket bacak tomurcuk, ucunda mevcut apikal, ektodermal bir sırtın (AER). zebrabalıkları Shh genetik mutantlar, araştırmacılar içine FGF batırılmış mikroboncukları implante Omurgalı uzvun 25 hücre döngüsünün ve büyüme ilerlemesi için gerekli olduğu FGF belirledi. Buna ek olarak Konumsal kimlik oluşturmak FGF ve Shh sinyalizasyon kaskadlar, kimlik 32 posterior anterior kurmak için kutuplaştırıcı bölgenin eylem taklit ederek molekül olarak retinoik asit (RA) tespit civciv bacak tomurcuk kullanarak öncü çalışmalar. Civciv bacak içine RA-batırılmış whatman küçük kağıt parçaları konur katılan Bu deneyler haneli desenlendirme 32 değerlendirmek için. Bundan başka, araştırmacılar, mikro kullanımını kullanan diğer şık çalışma yapmıştır, hücre transplantasyonu ve eksojenZebra balığı RA RA tedavileri Zebra balığı Beyin ve mezoderm 28 içinde uzun menzilli pozisyonel ipuçları sağlamak için hareket ettiğini tespit etmek. Ancak, şu anda birçok soru omurgalı gelişme birçok açıdan sırasında FGF ve RA gibi faktörlerin sinyal rolleri hakkında kalır. RA sinyal etkisi, bir morfogen gibi davranan, böyle RA proksimal böbrek hücreleri kaderlerini 35-39 tip belirten gelişen kalp ve böbrek 34 atalarıdır gibi pek çok organı 33, darbe. Bu tür konuların daha iyi anlaşılması doku manipülasyon ve microbead implantasyon teknikleri kullanılarak deneysel çalışmalar önemli ölçüde yarar olabilir.

Civciv gibi modellere kıyasla daha az çalışma Zebra balığı, içinde microbead implantasyonu ile yapılmıştır ederken, yürütülen edilmiş olanlar son derece bilgilendirici olmuştur. Zebra balığı embriyo microbead implantasyon esaslı araştırma azlığı bir nedeni likel olduğunuy bir engel başarıyla tür manipülasyonlar gerçekleştirmeden oluşturan embriyonun büyüklüğü dayalı, zor teknik zorluklar var olduğu fikri. Ancak, Zebra balığı embriyolar microbead implantasyon uygulaması ile öğrenilen ve tekniğin görsel gözlem yoluyla yardım ve böylece kalkınma mekanizmaları sorgulamak için bir araç olarak takip edilebilirler. Burada, doku oluşumu ve hücre morfogenez ilgili tahlillerde çeşitli iletilmesi için kullanılabilir zebra balığı embriyo, bir mikroboncuk kesin uygulama göstermektedir.

Protocol

Bu protokol açıklanan Zebra balığı embriyolarının ile çalışmak için prosedürler Notre Dame Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. Ringer Solüsyonu Hazırlama Herhangi bir tuz çökelmesini önlemek için sürekli karıştırma ile, aşırı saf, H2O ile 116 mM NaCI, 2.9 mM KCI, 3.6 mM CaCl2, 5 mM Hepes ihtiva eden bir çözelti yapmak. Tuzları, ekleme ve çözelti hala karıştırma sırasında sonra, 100 birim / mL başına penisilin ve ml başına 100 ug streptomisin ilave edin. Tüm antibiyotik ve bunların tuzlarını ilave edildikten sonra, steril bir kap içinde çözelti ve mağaza filtre sterilizasyonu gerçekleştirin. Not: N-feniltiyoüre (1-fenil-2-tioüre) ya da PTU embriyo sağlığına olumsuz sonuçlar doğurmadan kordon implante edilen embriyoların pigment oluşumunu engellemek için bir Ringer çözeltisine ilave edilebilir. Ringer / pigmentasyon bloke çözeltisinin hazırlanması için, konsantre ve kullanımı% 0.003 PTU trasyon. Nedeniyle PTU düşük konsantrasyona PTU tozun küçük miktarlarda eklenmesi önlemek için, Ringer çözeltisi daha büyük bir birim, en az 1 L yapılması tavsiye edilir eklenmelidir. Çözelti karıştırma sırasında, Aşama 1.2 sırasında PTU ekleyin. 2. Tricaine Çözelti Hazırlanması 9.5 arasında bir pH değerine, dengeli bir 1 M stoktan, çözeltisi artı 0.1 M Tris her bir L başına Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Tricaine) 2 g ekleyin ve ultra saf H2O ile yapılan Not: Tricaine boncuk implantasyon fenotipleri tahlil istenen bir zaman noktasında zebrabalıkları embriyolar ötenazi için kullanılacaktır. 3. E3 Çözüm Hazırlığı E3 1 L oluşturmak için, 0.25 M NaCI, 10 mM KCI, 12.5 mM CaCI2 ve 16.6 mM MgSO 4 ultra saf su L 1 bir çözelti yapmak. Mantar gelişimini inhibe etmek için, E3 çözeltisine Metilen Mavisi 200 ul ekle. Microbead Transferi 4. Çekme İğneler Bir OD filament ile ateş cilalı borosilikat cam kullanın: 1,0 mm, ID: 0.5 mm, 10 cm uzunluğunda. İnce iğne hazırlamak için Mikropipet çektirmenin içine borosilicated cam yerleştirin. Not: = 245, Velocity = 200 ve Zaman = 125 çekin, Isı = 540: Aşağıdaki dört boyut iğne çekmek için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir. Iğne yeterli sayıda çekerek sonra, kapalı plastik mağaza kullanıma kadar, modelleme kil veya iğne ucu kırılma önlemek için yapışkan bant şeritler üzerinde konumlandırılmış yemekler, petri. İstediğiniz delik boyutuna iğne ucu kırpmak için, iğnenin ucunu puan ince forseps bir çift kullanın. Not: İğne delik boyutu microbead boyutu kullanılan yanı sıra kullanıcı taşıma tercihleri ​​ediliyor bağlı olarak değişecektir. 50-100 um arasında değişen mikro-kullanılacak olması durumunda iyi bir başlangıç ​​noktası 100 ve 200 um arasında bir aralıkta zanaat motorunun boyutları etmektir. Prior tamamlanan microbead transferi enstrüman moda kılcal boru tutucu içine kesilmiş iğneyi kullanmak. 5. Bıyık / Kirpik Aracı Hazırlama Bir bıyık edinin kirpik ya da doğal ya da sentetik saç filamanın diğer küçük ama sağlam bir parça. 45 ° 'lik açıyla filamanın üssü yakınlarında kesti. Kalıcı net yapıştırıcı tutkal kullanarak, bir P-1000 mikropipet ucu bıyık uyun. 6. microbead İmplantasyonu Tepsi Hazırlık E3 çözeltisi, 100 ml% 2'lik bir E3 agaroz jeli yapmak için olan agaroz 2 g karıştırın. Içinde köpüren jelin önlemek amacıyla şişeye her 30 saniyede bir dönen, 250 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde 1 dakika ve 30 saniye süreyle% 2 agaroz çözeltisi ısıtın. 60 mm x 15 mm petri kapağını alın ve yukarı bakacak iç ile daha büyük, 150 mm x 15 mm çanak yerleştirin. Aşağı demirlemek için emin olun, 150 mm x 15 mm petri içine sıcak agaroz jel dökünişaret parmağı ile küçük çanak kapağı. Not: jel dökerken oluşturacak yoğunlaşma kaldırmak için küçük çanak kapağın altında agaroz ince bir tabaka izin ver; Bu bir diseksiyon mikroskop altında görmek için boncuk daha kolay hale getirecek. Agaroz soğurken katılaşır önce ama, jel üzerinde iyi kalıp yerleştirin. Bu embriyo kolay yerleştirilmesi için izin verir. Not: Bu jel üstünde yüzen kadar kuyularda kabarcıklarını önlemek için, bir açı ile yavaşça kalıp yerleştirin. Jel katılaşmış bir kez microspatula kullanarak, dikkatle de kalıp çıkarmak. 4 ° C'de E3 solüsyonu ve mağaza ekleyin. 7. Embriyo Koleksiyon Sistem su ile dolduruyor ve daha sonra odalarına O / N yetişkin zebrabalıkları erkek (ler) ve dişi (lar) çiftleri koyarak, bölücüler ile ayrılmış çiftleşme odaları, hazırlayın. Bir ince tel örgü süzgeç kullanarak döllenmiş yumurta toplamak (embriyonik aşamaları biraz değişecektir). Orada çanak E3 çözeltisi yaklaşık 25 ml süzgeç bırakılan yumurta kalmayana dek ters süzgeç tornalama ve E3 ince bir akımı ile durulanarak, temiz, 10 cm çapında bir Petri tabağına döllenmiş yumurta bırakır ve. Toplandıktan sonra, debriyaj içinde gelişim asenkroni yol ve zor istenilen kat puan toplayarak hale getirebileceğini aşırı kalabalık önlemek için çeşitli yemekler (tabak başına yaklaşık 50-60 yumurta) içine yumurta bölmek. Standart zebrabalıkları evreleme serisi 40 göre gelişimsel değerlendirme etkinleştirmek için 28.5 ° C'de E3 çözeltisi içinde embriyolar kuluçkaya yatmaktadır. Not: embriyolar eski aşamalarında manipülasyonlar optik netlik gerektiren eğer pigment gelişimini önlemek için 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf) E3 / PTU transfer edilmelidir. 8. Boncuk İmplantasyonu Istenen test molekülü konsantrasyonunda mikroboncukları veya karşılık gelen araç s inkübeuygun bir hacmi için gerekli bir süre için ların çözüme. Not: Araştırmacı steril Petri 3-6 cm çapında değişen yemekler, veya çözelti içinde mikro-görselleştirme sağlayacak her ikisi de çok-yuvalı plakalar, kullanabilir. Zaman tipi ve ilgili molekülün miktarına bağlı olarak değişebilir ve araştırmacı gibi ışık ve sıcaklık hassasiyeti olarak inkübasyon ve diğer yönleri süresince üretici ya da yayınlanan önerileri başvurmalıdır. Embriyolar istenilen gelişimsel zaman noktasını ulaştığınızda, ince forseps kullanarak chorions embriyolar kaldırın. Çözeltiye bunları alışmaları için 10 dakika boyunca antibiyotik süzüldü Ringer çözeltisi embriyolar inkübe edin. Embriyolar acclimating iken, implantasyon tepsi içinde yer mikroboncuk plaka mikroboncukları transferi ve 10 dakika boyunca Ringer çözeltisi ile durulayın. Not: Bu noktaya ulaştıktan sonra 50 dakika içinde boncuk implante. Bu wHasta bir ilgi, molekülün daha küçük bir konsantrasyon ile bir boncuk implante olasılığını azaltır. Implante edilecek microbead erişilebilir nereye kadar ilgi alanına onları yönlendirmek için özen microbead implantasyon tepsisinin kuyulara embriyolar dizisi. Tungsten iğne kullanılarak embriyo üzerinde küçük bir kesi yapmak. Microcapillary transfer pipet kullanarak embriyo üzerine microbead aktarın: pipet ampul karartıcı, yavaşça kılcal sütuna microbead çekin ve sonra istenen hedefe microbead transfer basıncı boşaltın. Embriyo içinde microbead konumlandırmak için bıyık / kirpik aracını kullanın. Not: iyileşene kadar microbead embriyo ihraç olmayacak şekilde kesi sitesinden uzak dokuya microbead konumlandırmak için emin olun.

Representative Results

Manipülasyon araçları çeşitli tipleri araştırma uygulamaları (Şekil 1), mikro-boncuklar için yararlıdır. Buna ek olarak, küçük kuyuları ile basit bir agaroz kalıp zamanında ve etkin bir şekilde (Şekil 1), bu deneyler gerçekleştirmek için hayati önem taşımaktadır Zebra balığı embriyo tutmak için kullanılabilir. Bir mikroboncuk implantasyonu araştırmacılar ilgi molekülü için spesifik bir eylem pencere dar sağlar mekansal bir konuma ve ilgili zamansal safhada gerçekleştirilebilir. Burada, tek mikroboncuklar kuyruk tomurcuk aşamasında Zebra balığı embriyolarının içine veya somitogenesis aşamaları (Şekil 3) sırasında daha sonra zaman noktalarında implante edildi. Tek başına Ringer çözeltisi ile çalkalandı iki farklı büyüklükteki mikro-boncukları, bu protokol gösteri (Şekil 3A, 3B ve 3C) kullanılmıştır. Herhangi bir konjuge yokluğunda bu microbead implantasyonuküçük moleküller boncuk implantasyonu Zebra balığı embriyo (Şekil 4) uygun gelişimi sırasında brüt morfolojik etkileri olmadan elde edilebileceğini göstermektedir. Deneyciler embriyo üzerinde bir tungsten iğne ile yapılan delinme deliğe microbead manevra zorluklar karşılaşabilirsiniz. Bir kez mikro iğne ile embriyo yerleştirilen mikroboncuk daha iyi yol tutuşu elde etmek için, bir bıyık / kirpik aracı kullanılabilir. Diğer doğal veya sentetik kirpik filamanlar (Şekil 1) kullanılabilir, ancak bu, doğal olarak kedi veya köpek bıyık döken ile hazırlanmış olabilir. Tungsten iğne veya bıyık aracı ile ya mikroboncuk bir nazik itme microbead kalıp Ringer çözeltisi içine batar görmelisiniz. Mikroboncuk kalıp içine batmış sonra eğer gerekiyorsa tungsten iğne kullanarak, büyük mesafelerde taşınması gereken ve bir kez embriyo tepesinde bir iğne ya da kıl aracı positio için kullanılabilirembriyonun içine microbead n. boncuk stabil dokuda konumlandırılmış kalacaktır olarak microbead implantasyon başarısı hemen bir stereomikroskopta görselleştirme yoluyla ölçülebilir. Zamanla boncuk konumunu değerlendirmek için, her embriyo örnek canlı zaman kurs fotoğraf yoluyla görüntülü olabilir ya da (Şekil 4'te gösterildiği gibi) boncuk konum nedeniyle endojen doku deney süresi boyunca kaymıştır değil emin olmak için periyodik aralıklarla kontrol morfogenez. Zamanla boncuk konumunu anlama bir hedef doku veya gelişim süreci, küçük bir molekül etkisini değerlendirmek olarak sonuç, en iyi şekilde bilinçli yorumlanması için kritik önem taşır. Bu yukarıdaki adımların kullanılması istenen zamanda ve konumda zebrafish embriyo içine mikroboncukları imbed etmek için ideal bir ortam sağlayacaktır. Bizim tecrübelerimize göre, bu microbead implantasyon protokolünün acemi kullanıcılar genellikle beceri NE kazandıUygulamada yaklaşık bir hafta sonra tek Zebra balığı embriyo içine mikro tutarlı cerrahi implantasyon gerçekleştirmek için cessary. Şekil 1. Araçlar microbead implantasyonu gerçekleştirmek için kullanılır. (A) boncuk implantasyonu tepsi (sol, 15 cm çapında) embriyo kalıpları ile (solda) ve microbead kuluçka tepsi (sağda, 6 cm çapında). Bu çalışma tepsi araştırmacı microbead implantasyonu için istenen yönelim içine embriyolar yerleştirmek ve mikroskop istasyonunda yakın implantasyon için hazırlanan mikroboncukları sahip sağlar. Mikro-küreler, küçük molekül (ler) ve / veya araç içinde bekletilir ve daha sonra bir mikroskop istasyonunun altına yerleştirilmiş köşe implantasyon tepsisine yerleştirmeden önce, ayrı bir microbead plakasına (sağ) durulanmalıdır. (B), ince forseps iki çift chori kaldırmak için kullanılacakmicrocapillary iğnenin ucunu kırmak için ayrıca her Zebra balığı embriyo çevreleyen ve üzerinde. (C) tungsten iğne mikroboncuk konumlandırmak için zebrafish embriyo içine çok ince bir delik yapmak için istihdam edilecek. (D) microcapillary transferi pipet pick up ve delinme site yakınında Zebra balığı embriyonun üstünde bir microbead konumlandırmak için kullanılacaktır. (E) daha önce bir tungsten iğne ile yapılan embriyo içinde insizyon içine mikroboncuk nazik konumlandırma sağlayacak bıyık / kirpik aracı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Microbead implantasyon prosedürü Şekil 2. şematik. (A) mikro-soaki ile microbead implantasyon tepsisiİstenilen yıkama çözeltisi içinde ng bir stereomikroskopta istasyonu altında kurmak ve embriyolar doku yukarı bakacak şekilde konumlandırılmış. Tungsten iğne kullanarak (B), embriyo içine küçük bir kesi hafif ama güçlü hareketi ile yapılabilir. Bir microcapillary transfer pipet kullanarak (C), istenen microbead sağda bulunan tepsideki microbead kuluçka odasına aldım ve embriyo çalışma alanı yer almaktadır sol bölmeye getirilebilir. microbead insizyon yeri yakınlarında tevdi edilmelidir yavaşça bıyık / kirpik aracını kullanarak tungsten iğne ile yapılan kesi içine yerleştirilmiş. Bir microbead kesi içine manevra sonra, stabil microbead konumlandırmak ve gelişme devam ettikçe embriyo dışarı sonraki hareketini engellemek için (Ensizyondan uzak) doku içine sıkışmış edilmelidir. Pkira bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. Şekil 3. mikroboncukları farklı gelişim aşamalarında embriyolar implante edilebilir. (A) Zebra balığı embriyolar kuyruk tomurcuk aşamasında gövde içine mikroboncuk (yaklaşık 50 mikron çapında) yerleştirildi. 24 saat sonrası boncuk implant (hpbi) olarak incelendiğinde, embriyolar normal geliştiği ve microbead gelişimsel zamanın geçişi sırasında minimal hareketi gösterdi. 3 hücre gruplarının aşama (P) de sarısı kesesinin içine (yaklaşık 50 um'lik bir çapa sahip) mikro implante (B) balığı embriyolar zaman içinde nispeten küçük bir kordon hareketiyle normal gelişimini göstermiştir. (C) daha büyük mikro-(yaklaşık 70 um çapında) benzer şekilde, normal sonraki gelişimini, yanısıra mini gösterdi 7 ss embriyo içerisine implante edildimal implantasyon siteden herhangi bir hareket. eğer bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Zebra balığı embriyo Şekil 4. Brüt gelişimi 72 hpbi ile mikroboncuk varlığı ile tedirgenmemis olan. Balığı embriyolar 7 hücre gruplarının aşaması (SS) (yaklaşık 50 um'lik bir çapa sahip) Ringer çözeltisi içinde ıslatılmış mikro implante edildi. Her microbead cerrahi Somitlerin 3 ile 4 arasında, gövde içine sokulmuş boncuk varlığı 24 saat sonrası boncuk implant açık gelişimsel kusurlar (hpbi), 48 hpbi veya 72 hpbi ile ilişkili değildi. Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümü.

Discussion

Geçtiğimiz yüzyılda, vücut planı desen ve organogenez anlayışı anıtsal gelişmeler uğramıştır. Doku manipülasyon teknikleri bu hayati süreçler hakkında önemli bilgiler açığa çıkarmak kritik idi. Genetik modifikasyonlar gen fonksiyonu tespit etmek için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biri, ve bu hücre transplantasyonu olarak mozaik analiz yöntemleri, gen fonksiyonunun otonomisini anlamak için yararlı bir yaklaşım sağlarlar. Microbead implantasyon bu yöntem sinyal molekülleri veya inhibitörleri getirerek bir lokal doku ortamı değiştirmek için araştırmacı sağlayan olarak, gelişimsel dinamikleri nasıl değiştirdiğini belirli molekülleri sorgulamak için başka bir mekan sağlar. Farklı mikro bir dizi farklı boyutlar ve diğer fiziksel özellikler de ilgi deney koşulları için kullanılabilir, öyle ki (örneğin, şarj) mevcut olması, ticari olarak temin edilebilir. Böylece, bir protein veya kimyasal ıslatılır mikroboncuklar implanteBir organizmanın içinde ilgi cal, araştırmacılar gelişim sırasında lokalize etkilerinin araştırılması ve gen veya ilgi ve özellikle biyolojik fenotip (ler) molekülü arasındaki ilişkiyi bulabilirsiniz.

Böyle zebrabalıkları 23 ön neurocranium (ANC) iskelet yapısının artan Kirpi sinyalizasyon etkisini değerlendirmek amacıyla microbead implantasyonu kullanılan Wada tarafından gerçekleştirilen bir ve meslektaşları olarak çalışmalar. Önceki çalışmalar, Shh ANC formasyonu 14 için gerekli olduğunu göstermiştir. Kullanımı Şşş kaplı mikroboncuklar araştırmacılar bu sinyal DÖB kıkırdak oluşumunu teşvik ettiğini belirledi. microbead implantasyon işlemi DÖB Kirpi sinyalizasyon ve kıkırdak oluşumu arasında açık bir bağlantı göstermek için kullanılmıştır. Bilim adamları eritroblastom Yirmi altı transkripsiyonel kontrol araştırdık nerede zebrafish bu doku manipülasyonu tekniğinin bir diğer önemli örnek çalışmalarda gözlenmiştir (ETS) etki faktörler ETS ilgili molekül (Erm) ve erken zebrabalıkları beyin gelişimi 19 sırasında FGF sinyalizasyon tarafından Polyoma arttırıcı aktivatör 3 (Pea3). Microbead implantasyon deneyleri sayesinde, onlar FGF8 ve Fgf3 ektopik erm ve Pea3 ifadesini aktive göstermek başardık. Bu örnekler, gen ekspresyonunu değerlendirmek için 41 yöntemleri ile iyi karakterize edilebilir, doku oluşumu sırasında işbirliği gelişim mekanizma içine anlayış sağlamak için mikro yararını göstermektedir. Böylece, microbead nakli gibi böbrek yol açan orta mezoderm (IM) gibi diğer dokuları, keşfetmek için uygun bir yöntem olabilir. Özellikle, nefron 42 segmentasyon ve 43,44, sadece yüzeysel şu anda anlaşılan süreçler tubulogenesis nasıl etkilediğini farklı moleküller araştırmak için, böbrek gelişim çalışmalarında yardımcı olacaktır. Ayrıca, microbead implantasyonu damızlık için kullanılmaya başlanmıştır ettizebrabalıkları 29] ve y rejenerasyon işlemleri gibi karşılık gelen yetişkin yapılarıyla araştırma yapmak için formüle edilmiştir yöntemlerle nefron 45 veya bağlantılı olduğu gibi, embriyonik doku takiben lazer ablasyonu gibi, organ yenilenmesi model, herhangi bir sayı ile kullanılmak üzere adapte edilebilir 46-49. Son olarak, mikroboncuk implantasyon kanser 50,51 veya doku dejenerasyonu 52,53 insan hastalık modelleri, kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir.

Mevcut protokolde, biz de benzer şekilde, diğer araştırmacılar tarafından açıklanan, ancak video protokolleri 1 ile gösterilmeyen olmuştur Zebra balığı embriyolarının microbead implantasyonu, yöntemini göstermektedir. Minimal uygulama ile biz araştırmacı bazı tecrübeye sahip bir zamanlar bu prosedürün fizibilitesini ilgilidir 8-10 embriyoların yaklaşık oranı / saat, en mikroboncukları implant başardık. Burada gösterilen sonuçlar, çeşitli d o boncuk göstermektedirimensions erken dönemde implante edilebilir ve dikkatle ki bu doku manipülasyonu tekniği embriyo minimal fiziksel bozulma ile uygulanabilir. Vurgulanmalıdır Bir gelişme embriyo mikroboncuk konumlandırmak için bir bıyık / kirpik aracının kullanılmasıdır. Bu ekipman nispeten ucuz ve basit parça mikroboncuk aynı çapta hakkında elde etmek kolaydır ve implantasyon sürecini hızlandırmak yardımcı olur. bıyık / kirpik araştırmacı el becerisi ve tercihine bağlı olarak, henüz narin boncuk işleme aracı bir firma üretmek için istenen uzunlukta kesilebilir. Burada fiziksel implantasyonu gerçekleştirmek için mikroboncukları ve zebra balığı embriyolar işlemek için nasıl tarif ederken son olarak, bu protokol, farklı ilaçlar veya peptidler için özel taşıma prosedürleri anahat değildir. Genel olarak, kimyasal işlem görmüş mikro-organizmanın başka alanlarda istenmeyen etkileri engellemek için, çıkar olan hayvana implante edilmesi gerekir, ve araştırmacılar de olmalıdırçalışmalarını başlatmadan önce bu tür kimyasallarla ilişkili olası güvenlik kaygıları hakkında kurdu.

Sonuç olarak, biz laboratuarda kolayca bulunabilen başlangıç ​​malzemeleri kullanılarak, geniş bir uygulama yelpazesi ile nispeten basit ve etkili bir mikroküre implantasyon yöntemi gösterilmiştir. Sonuçta, biz bu kılavuz Zebra balığı doku manipülasyonu hassas doğası ile araştırmacıların yardımcı olacağını umuyoruz.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH hibe DP2OD008470 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
HEPES Sigma Life Science H4034
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-20ML
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
250mL Erlenmeyer Flask Fischer Scientific FB-500-250
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile Corning 430167
60mm x 15mm VWR 25373-085
100mm x 15mm VWR 25373-100
150mm x 15mm VWR 25373-187
Saint-Gobain Chemware Microspatula Fischer Scientific 21-401-50B
P-1000 Micropipette tips Fischer Scientific 2707402
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Dimethly Sulfoxide American Bioanalytical AB00435
Microbeads (45-106 µm) Biorad 140-1454 AG1-X8
Microbeads (45 µm) Polysciences 7314
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Tungsten Needle Roboz Surgical Instruments Co. RS-6065
Capillary tube holder Globe Scientific Inc.  51674
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Picker, A., et al., Lieschke, G. J., et al. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Zebrafish, Methods in Molecular Biology. 546, (2009).
  2. Wilson, J., Tucker, A. S. Fgf and Bmp signals repress the expression of Bapx1 in the mandibular mesenchyme and control the position of the developing jaw joint. Dev Biol. 266, 138-150 (2004).
  3. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  4. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  5. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  6. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  7. Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
  8. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  9. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl Res. 163, 65-78 (2014).
  10. Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. J Vis Exp. 89, e51708 (2014).
  11. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  12. Auer, T. O., Del Bene, F. CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish. Methods. 69, 142-150 (2014).
  13. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 12965-12969 (2000).
  14. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, e52063 (2011).
  15. Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high–throughput using zebrafish embryos. J Vis Exp. , 52063 (2014).
  16. Hyatt, G. A., Schmitt, E. A., Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Dräger, U. C., Dowling, J. E. Retinoic acid establishes ventral retinal characteristics. Development. 122, 195-204 (1996).
  17. Picker, A., Brand, M. Fgf signals from a novel signaling center determine axial patterning of the prospective neural retina. Development. 132, 4951-4962 (2005).
  18. Reifers, F., Walsh, E. C., Leger, S., Stainier, D. Y. R., Brand, M. Induction and differentiation of the zebrafish heart requires fibroblast growth factor 8 (fgf8/acerebellar.). Development. 127, 225-235 (2000).
  19. Raible, F., Brand, M. Tight transcriptional control of the ETS domain factors Erm and Pea3 by Fgf signaling during early zebrafish development. Mech Dev. 107, 105-117 (2001).
  20. Reim, G., Brand, M. spiel-ohne-grenzen/pou2. mediates regional competence to respond to Fgf8 during zebrafish early neural development. Development. 129, 917-933 (2002).
  21. Jaszai, J., Reifers, F., Picker, A., Langenberg, T., Brand, M. Isthmus-to-midbrain transformation in the absence of midbrain-hindbrain organizer activity. Development. 130, 6611-6623 (2003).
  22. Hirati, Y., Okamoto, H. Canopy1, a novel regulator of FGF signaling around the midbrain-hindbrain boundary in zebrafish. Curr Biol. 16, 421-427 (2006).
  23. Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  24. Abe, G., Ide, H., Tamura, K. Function of FGF signaling in the developmental process of the median fin fold in zebrafish. Dev Biol. 304, 355-366 (2007).
  25. Prykhozhij, S. V., Neumann, C. J. Distinct roles of Shh and Fgf signaling in regulating cell proliferation during zebrafish pectoral fin development. BMC Dev Biol. 8, 91 (2008).
  26. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis controls spreading and effective signaling range of Fgf8 protein. Curr Biol. 14, 1834-1841 (2014).
  27. Hardt, S., et al. The Bmp gradient of the zebrafish gastrula guides migrating lateral cells by regulating cell-cell adhesion. Curr Biol. 17, 475-487 (2007).
  28. White, R. J., Nie, Q., Lander, A. D., Schilling, T. F. Complex regulation of cyp26a1 .creates a robust retinoic acid gradient in the zebrafish embryo. PLoS Biol. 5, e2522-e2523 (2007).
  29. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  30. Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R., Tickle, C. A positive feedback loop coordinates growth and patterning in the vertebrate limb. Nature. 371, 609-612 (1994).
  31. Laufer, E., Nelson, C. E., Johnson, R. L., Morgan, B. A., Tabin, C. Sonic hedgehog and Fgf-4 act through a signaling cascade and feedback loop to integrate growth and patterning of the developing limb bud. Cell. 79, 993-1003 (1994).
  32. Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bud mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
  33. Samarut, E., Fraher, D., Laudet, V., Gibert, Y. ZebRA: an overview of retinoic acid signaling during zebrafish development. Biochimica et Biophysica Acta. 1849, 73-83 (2015).
  34. Lengerke, C., et al. Interactions between Cdx genes and retinoic acid modulate early cardiogenesis. Dev Biol. 354, 134-142 (2011).
  35. Wingert, R. A., et al. The cdx and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  36. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  37. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom., and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a. transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev Biol. 399, 100-116 (2015).
  40. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  41. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604 (2014).
  42. Cheng, C. N., Wingert, R. A., Carver, E., Lessman, C. Chapter 9: Renal system development in the zebrafish: a basic nephrogenesis model. Zebrafish: Topics in Reproduction & Development. , (2014).
  43. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota .and zeta. Dev Biol. 396, 183-200 (1016).
  44. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr Patterns. 16, 104-113 (2014).
  45. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. , e2845 (2011).
  46. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  47. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, e2839 (2011).
  48. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , e51644 (2014).
  49. McCampbell, K. K., Springer, K., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cells Int. In press, (2015).
  50. Lee, S. L., et al. Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19485-19490 (2009).
  51. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Prot. 5, 1911-1918 (2010).
  52. Cao, R., Jensen, L. D. E., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3, e2748 (1371).
  53. Cao, Z., et al. Hypoxia-induced retinopathy model in adult zebrafish. Nat Prot. 5, 1903-1910 (2010).

Tags

ZebrafishBiología del desarrolloDisease ModelOrganogenesisMicrobead ImplantationSignaling MoleculesEmbryo

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (101), e52943, doi:10.3791/52943 (2015).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image