qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Leslie A. Mitchell; Nick A. Phillips; Andrea Lafont; James A. Martin; Rupal Cutting; Jef D. Boeke

doi:10.3791/52941

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biología

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

Published: May 25, 2015

doi:

10.3791/52941

Leslie A. Mitchell¹, Nick A. Phillips¹, Andrea Lafont², James A. Martin¹, Rupal Cutting², Jef D. Boeke¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,Institute for Systems Genetics, ²Roche Life Science, USA

Summary

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Abstract

مشروع الجينوم الخميرة الاصطناعية (Sc2.0) يهدف إلى بناء 16 مصمم الكروموسومات الخميرة والجمع بينهما في خلية الخميرة واحدة. حتى الآن كروموسوم واحد الاصطناعية، synIII ^1، وذراع واحدة كروموسوم اصطناعي، synIXR ^2، وقد تم بناؤها وظيفتها في الجسم الحي التحقق في غياب المقابلة الكروموسومات نوع البرية. ميزة تصميم هامة من الكروموسومات Sc2.0 هو إدخال PCRTags، والتي هي، تلوينها إعادة تسلسل قصيرة ضمن أطر القراءة المفتوحة (ORFS) التي تمكن التفريق بين الكروموسومات الاصطناعية من نظرائهم نوع البرية. PCRTag الاشعال يصلب بشكل انتقائي إما الاصطناعية أو البرية الكروموسومات نوع وحضور / غياب كل نوع من الحمض النووي يمكن اختبارها باستخدام فحص PCR بسيط. قراءات القياسية لفحص PCRTag هي لتقييم وجود / غياب amplicons بواسطة agarose هلام الكهربائي. ومع ذلك، مع متوسط كثافة PCRTag amplicon واحد لكل 1.5 كيلوبايت وAGenome حجم ~ 12 ميغابايت، فإن الجينوم Sc2.0 الانتهاء ترميز ما يقرب من 8000 PCRTags. لتحسين الإنتاجية، قمنا بتطوير فحص الكشف PCR القائم في الوقت الحقيقي لPCRTag التنميط الجيني الذي نسميه تحليل qPCRTag. يحدد سير العمل 500 ردود الفعل نيكولا لانغ في 1536 لوحة multiwell، مما يسمح لنا لاختبار ما يصل الى 768 PCRTags مع كل من أزواج نوع التمهيدي الاصطناعية والبرية في تجربة واحدة.

Introduction

Sc2.0، أو مشروع الجينوم الخميرة الاصطناعية ( www.syntheticyeast.org )، وقد وضعت هدف تصميم وبناء جينوم وحيد الخلية الاصطناعية تماما. باستخدام تسلسل الجينوم برعاية عالية من خميرة الخباز ³ كنقطة انطلاق، وقد تم إعادة تصميم كل واحد من الكروموسومات الخطية ستة عشر لقاء مجموعة من مبادئ التصميم التي تحدد الحفاظ على اللياقة البدنية الخلية، وتحسين الاستقرار الجينوم، وزيادة المرونة الوراثية. على سبيل المثال، يتم حذف العناصر المزعزعة للاستقرار مثل يكرر من الكروموسومات Sc2.0. كلها حالات TAG كودونات توقف إعادة ترميز إلى TAA إلى "تحرير" كودون في سلالة النهائي لإدخال حمض أميني غير المشفرة وراثيا. بالإضافة إلى نظام تطور محرض، والتدافع، مكن من قبل النظام جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، يسمح قدرة غير مسبوقة لتوليد الجينوم مشتقة مع هياكل جديدة ^4.

<p class="jove_content"> عنصر تصميم رئيسي آخر في الجينوم Sc2.0 هو إدخال PCRTags، التي تكون بمثابة علامات مائية DNA لتمكين تتبع الحمض النووي نوع الاصطناعية والبرية. PCRTags هي قصيرة، تلوينها إعادة قطاعات في ORFS على الكروموسومات الاصطناعية. في حين تختلف تسلسل PCRTag على مستوى الحمض النووي بين نوع الكروموسومات الاصطناعية والبرية، والبروتينات المشفرة متطابقة في تسلسل الأحماض الأمينية وبالتالي، يفترض، وظيفة. صممت خصيصا تسلسل PCRTag كمواقع ملزمة التمهيدي لتسهيل التضخيم الانتقائي (الشكل 1A). ويتم تصميم PCRTag خارج باستخدام 'معظم مختلفة "الخوارزمية في GeneDesign ^5،6، مما أسفر عن تكبد تسلسل الاصطناعية التي عادة ما تكون ~ 60٪ يختلف عن تسلسل الأم (الحد الأدنى 33٪) مع درجات حرارة انصهار بين 58 درجة مئوية و 60 درجة مئوية، و amplicon أطوال بين 200-500 أزواج قاعدة ^2. لا يجوز إعادة ترميز داخل BP 100 الأول من كل ORF، كما تعرف هذه المناطق للدينا أفضليات خاصة من حيث استخدام كودون ^7. معا، وهذه قواعد التصميم لصالح الأداء العالي من PCRTags كلها تقريبا تحت مجموعة واحدة من الشروط PCR حيث نوع PCRTag أزواج التمهيدي الاصطناعية والبرية ربط حصرا وتضخيم DNA الاصطناعية والأصلي، على التوالي (الشكل 1B).

الشكل 1: PCRTag التخطيطي (A) PCRTags وتسلسل ضمن أطر القراءة المفتوحة (ORF) من الجينات على الكروموسومات Sc2.0 إعادة تلوينها. (B) الاصطناعية (SYN) والنوع البري (WT) الاشعال PCRTag ربط حصرا وتضخيم نوع الاصطناعية والبرية الحمض النووي الجيني (gDNA)، على التوالي. المبين هنا هو تحليل لشريحة كيلوبايت ~ 30 من الذراع الأيسر من كروموسوم ستة، واختبار ثلاثة عشر PCRTag أزواج التمهيدي باستخدام WT أو شبه synVIL2 gDNA كقالب. في كثير من الحالات ORF واحد يشفر أكثر من واحد PCRTag. ويتم تقييم وجود / غياب amplicons PCRTag عبر الاغاروز الكهربائي للهلام. amplicons PCRTag تتراوح في حجمها من 200 نقطة أساس إلى 500 نقطة أساس. أسرع الأنواع المهاجرة في الجزء السفلي من لوحات هي dimers التمهيدي.

وقد ثبت تحليل PCRTag أن تكون أداة هامة في التجمع من الكروموسومات Sc2.0. في نموذجي التجربة 30-50 كيلو بايت من الحمض النووي الاصطناعي، ترميز 20-30 PCRTags، تتحول إلى خلايا الخميرة لتحل محل النوع البري المقابلة DNA ^1،2،8. ثم يتم استخدام تحليل PCRTag لتحديد transformants التي تكود الاصطناعية ولكن لا البرية نوع PCRTags يمتد هذا الجزء من الحمض النووي، أو ما يسمى ب "الفائزين". فإنه عادة ما يكون ضروريا لاختبار transformants متعددة لتحديد "الفائزين"، لذلك الإنتاجية وتكلفة التحليل PCRTag اعتبارات هامة. حاليا تم الانتهاء من اثنين من الكروموسومات Sc2.0 (synIII ¹ وsynIXR ^2)، وهو ما يمثل أقل من 10٪ من الجينوم Sc2.0، بديلهوغ أكثر من نصف الكروموسومات المتبقية يخضعون حاليا التوليف والتجمع. مقياس التحليل PCRTag المطلوبة لهذا المشروع يفوق بسرعة القدرة على تشغيل المواد الهلامية ويدويا يسجل وجود الحمض النووي الاصطناعي وعدم وجود DNA النوع البري.

لتحسين الإنتاجية للمقايسة PCRTag قمنا بتطوير العمل في الوقت الحقيقي باستخدام PCR للتحايل على استخدام الاغاروز الكهربائي للهلام. سير العمل يجعل من استخدام موزع السائل بكميات كبيرة لتوزيع QPCR mastermix في كل بئر من 1536 لوحة multiwell، والنانو موزع السائل الصوتية لنقل الحمض النووي قالب والاشعال، وcycler الحرارية 1536 QPCR، مما يسمح لنا تصغير ردود الفعل على 500 NL و تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية. يمكن أن تكون آلية تحليل وعلاوة على ذلك. وينبغي أن يكون هذا النوع من إنتاجية عالية بروتوكول التنميط الجيني للتعميم على أي مشروع يتطلب تحليل العديد من الحيوانات المستنسخة في مواضع متعددة.

Protocol

1. إعداد الحمض النووي الجيني الخميرة (gDNA) إعداد مخزون من الخميرة الاحتياطي تحلل 9 يحتوي على 50 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 100 مم كلوريد الصوديوم، 1٪ SDS (ث / ت)، 2٪ تريتون X-100 (V / V)، 1 ملم EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0. كما تبدأ استخدام المواد ~ 2 × 10 6 خلايا، والتي تتطابق عادة إلى ~ 100 ميكرولتر من ثقافة مشبعة لسلالات مختبر للBY4741 10 الخلفية. وينبغي جمع الخلايا المستزرعة بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة في أنبوب 1.5 مل microfuge. نضح طاف. إضافة 200 ميكرولتر من الخميرة الاحتياطي تحلل و resuspend بيليه الخلية بواسطة pipetting. إضافة ~ 300 ميكرولتر من حمض غسلها الخرز الزجاجي مثل أن مستوى الخرز حوالي 1 ملم دون مستوى الطين الخلية. في غطاء الدخان إضافة 200 ميكرولتر من الفينول / كلوروفورم / كحول أيزو أميلي (25: 24: 1). سقف لmicrofuge أنبوب وضمان عدم وجود حبات عالقون بين الغطاء وأنبوب لأن ذلك سيؤدي إلى تسرب خلال الهز(الخطوة 1.6). عكس 3 مرات لخلط والتحقق من اغلاق الغطاء. هز أنبوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام خلاط الفوق مثل إيبندورف 5432. الطرد المركزي في 20800 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. نقل 75 ميكرولتر من المرحلة المائية لأنبوب microfuge جديدة تحتوي على 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. عكس 10 مرات لخلط. بيليه الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي في 20800 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. نضح طاف دون طرد بيليه DNA. غسل بيليه مع 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪. الطرد المركزي في 20800 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح طاف دون طرد بيليه DNA والهواء الجاف بيليه مع غطاء microfuge مفتوحة حتى تبخرت الايثانول الزائد، الذي هو عادة حوالي 10 دقيقة. Resuspend وبيليه الحمض النووي في 75 ميكرولتر من 10MM تريس 7.4 درجة الحموضة ودوامة لخلط. تخزين العينة في -20 ° C إلى أجل غير مسمى. قياس تركيز الحمض النووي في العينة باستخدامالفوق مقياس التألق مثل و qubit، والذي يميز الحمض النووي RNA من. تأكد من أن تركيز النهائي من gDNA هو ~ 1-2 نانوغرام / ميكرولتر. إعداد 1:10 تخفيف من الحمض النووي الجيني باستخدام المياه ودوامة لخلط. قسامة 30 ميكرولتر من المخفف gDNA في البئر المناسب لوحة مصدر متوافق مع موزع السائل الصوتية النانو (الخطوة 3). في حالة استخدام Labcyte صدى 550، استخدم لوحة البولي بروبلين 384 بئر (384PP لوحة). ملاحظة: عندما مختومة بشكل مناسب هذه اللوحة يمكن تخزينها لمدة شهر واحد على الأقل في -20 ° C. 2. إعداد والاستغناء QPCR ميكس ماجستير في 1536 لوحة Multiwell إعداد 850 ميكرولتر من QPCR مزيج الرئيسي، مثل LightCycler 1536 DNA الأخضر الماجستير، في أنبوب 1.5 مل microfuge ودوامة لخلط. أجهزة الطرد المركزي لمزيج الرئيسي QPCR لمدة 2 دقيقة على 20800 XG في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي فقاعات. مكونات مزيج الرئيسي QPCR اللازمة لواحد 1536 لوحة multiwell هي على النحو التاليالصورة: الجمع بين 170 ميكرولتر من مزيج الرئيسي انزيم (ماجستير الأخضر أنبوب 1، 5X تتركز)، 42.5 ميكرولتر من SYBR (ماجستير الأخضر الأنبوبة 4، 20x ومركزة)، و637.5 ميكرولتر من الماء. الاستغناء عن 500 NL / جيد في 1536 لوحة multiwell باستخدام موزع السائل بكميات كبيرة مثل فن روبنز كوبرا. (لاحظ أن الخطوات 2.2.1-2.2.4 تشير تحديدا إلى كوبرا). إنشاء برنامج صرف بالإعدادات التالية: فئة السائلة، والمياه. حجم نضح، 800 ميكرولتر. الاستغناء عن حجم، 500 NL. غسل الوقت، و 20 ثانية. في إعدادات الاستغناء، تحقق من تعيين سرعة الاستغناء إلى 49.6 ملم / ثانية، والاستغناء الإزاحة 0.25 ملم، وسيتم الاستغناء السائل يستنشق الزائدة إلى مصدر جيد. وضع microfuge أنبوب يحتوي على مزيج الرئيسي QPCR بشكل جيد A1 من صاحب microfuge أنبوب، والذي يقع في موقف سطح السفينة 1. قطع الغطاء من microfuge أنبوب أو ببساطة تركه مفتوحا. مجموعة 'نضح جيدا' لA1 طريق تحرير Aspiratضبط البريد. أداء خطوة غسل قبل الاستغناء QPCR مزيج الرئيسي كتبها الخطوات الأولى لنضح والاستغناء-اختيار دي البرنامج بإعدادها في الخطوة 2.2.2 ثم ضرب 'تشغيل'. مرة واحدة كاملة، وإعادة تحديد نضح والاستغناء عن الخطوات السابقة لتشغيل البرنامج الكامل للاستغناء QPCR مزيج الرئيسي. إذا كان كوبرا كان يجلس خاملا لمدة أقل من 10 دقيقة الخطوة غسل الأولية، والذي يعمل على رئيس النظام، لا لزوم لها. ضرب 'تشغيل' للاستغناء QPCR مزيج الرئيسي إلى كل بئر. جمع مزيج الرئيسي QPCR في الجزء السفلي من كل بئر بواسطة الطرد المركزي وجيزة من 1536 لوحة multiwell (30 ثانية باستخدام سرعة منخفضة PCR لوحة الدوار). 3. الاستغناء عن قالب DNA والاشعال في 1536 Multiwell اللوحة الاستغناء عن 5 NL المخفف gDNA (الخطوة 1.3) في الآبار المرجوة من 1536 لوحة multiwell باستخدام نظام نقل السائل الصوتية، مثل صدى 550. للالشروقس 550، استخدام البرنامج لوحة إعادة صياغة أو بدلا من ذلك توفير مخصص جداول البيانات إكسل لبرنامج نقل. ضمان المصدر المحدد جيدا للgDNA في يطابق برنامج المصدر كذلك إلى الذي قمت الاستغناء جسديا gDNA (الخطوة 1.3). اختر نوع لوحة المصدر '384PP_AQ_BP2 "، مما يدل على السائل في لوحة 384PP هو عازلة دون السطحي. الاستغناء عن 10 NL الاشعال، ويخلط مسبقا إلى الأمام وعكس إلى تركيز النهائي من 50 ميكرومتر لكل منهما، في الآبار المرجوة من 1536 لوحة multiwell باستخدام نظام نقل السائل الصوتية، مثل صدى 550. لنظام نقل السائل، استخدام البرنامج لوحة إعادة صياغة أو بدلا من ذلك توفير مخصص جداول البيانات إكسل لبرنامج نقل. ملاحظة: وهنا من الممكن الاستغناء الاشعال مثل هذا التخطيط على 1536 لوحة multiwell يطابق ترتيب الكروموسومات من الاشعال لذلك فمن السهل أن تفقد البصر النتائج في الوقت الحقيقي PCRفي وقت لاحق (الخطوة 6). خلائط جاهزة الاشعال في لوحة والتي تتوافق مع موزع السائل الصوتية. لصدى 550، استخدم Labcyte 384LDV (انخفاض حجم القتلى) لوحة واختيار نوع لوحة المصدر '384LDV_AQ_B "عندما برمجة صدى للدلالة على السائل حاجز بسيط مع عدم وجود البروتينات. 4. ختم وأجهزة الطرد المركزي في 1536 Multiwell اللوحة باستخدام نظام سداده صفيحة ميكروسكوبية مثل Plateloc صفيحة ميكروسكوبية الحرارية السدادة، وختم على الفور 1536 لوحة multiwell باستخدام الختم واضح بصريا متوافق مع الصك السداده الحرارة. لا تلمس سطح الختم لتجنب علامات طخة. في حالة استخدام Plateloc الحرارية صفيحة ميكروسكوبية السدادة، واستخدام الإعدادات التالية: ختم الوقت 2.0 ثانية، ودرجة الحرارة ختم 162 ° C، وضغط الهواء 82 رطل. هذا الصك يأخذ ~ 5 دقائق لتسخين ولذا يجب أن يكون قيد التشغيل مسبقا. في حالة استخدام Plateloc صفيحة ميكروسكوبية الحرارية السدادة، وهو adapteيجب استخدام r لرفع ذروة لوحة multiwell 1536 على المسرح من أداة لضمان ختم جيدة. ملاحظة: على الرغم من أنه من الأفضل لشراء المرحلة لوحة لPlateloc صفيحة ميكروسكوبية الحرارية السدادة، حلا بديلا هو لإدراج أربعة ~ 2 مم غسالات مستوى سميكة المتاحة في أي متجر لاجهزة الكمبيوتر في الزوايا لرفع ذروة 1536 لوحة multiwell. أجهزة الطرد المركزي على الفور مختومة لوحة 1536 multiwell في 2000 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لجمع كل الكواشف في الجزء السفلي من كل بئر. 5. في الوقت الحقيقي PCR البرنامج 1536 QPCR الصك، مثل LightCycler 1536، مع بروتوكول التضخيم من خطوتين يعقبه تحليل منحنى ذوبان. عن طريق تعيين LightCycler 1536 برنامج برنامجا على النحو التالي: مرحلة ما قبل الحضانة: 95 ° C، عقد 1 دقيقة، ومعدل منحدر 4.8 ° C / ثانية، أي الاستحواذ. اثنين الخطوة التضخيم: 30 دورات من [95 ° C، لا الانتظار،المنحدر معدل 4.8 ° C / ثانية، أي اكتساب؛ 64 ° C، 30 ثانية الانتظار، معدل زيادة 2.5 ° C / ثانية، واقتناء واحد]. تذوب منحنى: 95 ° C، 10 ثانية، ومعدل منحدر 4.8 ° C / ثانية، أي الاستحواذ. 60 ° C، 1 دقيقة، ومعدل منحدر 2.5 ° C / ثانية، أي الاستحواذ. 97 ° C، ومعدل منحدر 0.1 ° C / ثانية، 5 الاستحواذ / ° C (مستمر). باردة: 40 ° C، 30 ثانية، ومعدل منحدر 2.5 ° C / ثانية، أي الاستحواذ. تعيين تنسيق كشف أن 'الأخضر الإقحام صبغ "في علامة التبويب تشغيل الوضوح. تعيين تحكم pipetting لل"التحكم الرئيسية" في علامة التبويب تشغيل الوضوح. تخدم هذه الميزة باعتبارها الرقابة الداخلية وبالكشف عن وجود QPCR مزيج الرئيسي في كل بئر من 1536 لوحة multiwell، وهو أمر مفيد للتعرف على السلبيات كاذبة المفترضة. إدراج 1536 لوحة multiwell أعد في الخطوات 2-4 في QPCR صك 1536 وتشغيل البرنامج. تحليل 6. البيانات الأداء الإقتصادي الأداءاسندت الفحص البصري من البيانات داخل البرنامج QPCR. ملاحظة: البرنامج 1536 يمكن تصور كل من التضخيم وتذوب منحنيات، فضلا عن حرارة خريطة تظهر المكالمة (الإيجابية والسلبية، غير صالحة، N / A؛ الشكل 2)، وقيمة معبر (انزلاق مقياس اللون لإيجابية أو الرمادي لسلبية؛ الشكل 3)، أو مضان نقطة النهاية (EPF) بقيمة (انزلاق مقياس اللون). تصدير البيانات من البرنامج 1536 في شكل ملف. txt (جدول النتائج) أو ملف. xml مع أي من البيانات الخام أو البيانات المحسوبة لتجهيز حاليا من الصك. ملاحظة: الملكية معبر الآلي (اف ب) خوارزمية الدعوة في صلب البرامج 1536 تأخذ بعين الاعتبار الشكل والمنحدر من منحنى التضخيم مع تحديد / دعوات قيمة السلبية والإيجابية حزب المحافظين بثقة عالية، في مجلدات رد فعل ميكروليتر منخفض الباطن مع منخفضة نسبيا قيم مضان. إذا كان LightCycler DNA الأخضر ماستر استخدامد لQPCR، تحقق من أن جميع الآبار مرت "التحكم الرئيسية". تفشل يشير لم البئر لا تتلقى QPCR مزيج الرئيسي وينبغي النظر في نقطة البيانات المفقودة سلبية كاذبة المحتملة. تحقق من أن جميع الآبار مرت "التحكم الرئيسية". تفشل يشير لم البئر لا تتلقى mastermix DNA والنظر في نقطة البيانات المفقودة سلبية كاذبة المحتملة.

Representative Results

اختبرنا الاصطناعية والبرية نوع كروموسوم 3 أزواج التمهيدي PCRTag 1 مع الخميرة الحمض النووي الجيني (gDNA) المستخرجة من أربع سلالات مختلفة. كروموسوم 3 لديه 186 PCRTag أزواج التمهيدي التي تمتد على طول الكروموسوم (synIII هو ~ 270 كيلوبايت والنوع البري كروموسوم 3 غير ~ 315 كيلو بايت). لاختبار كل من السلالات الأربع مع كل من مجموعتي الاشعال، قسمنا لوحة multiwell إلى أربعة أجزاء، واحد لكل نوع من gDNA، وتكليف الاشعال PCRTag الاصطناعية إلى النصف العلوي من كل رباعي والنوع البري إلى النصف السفلي. تم استخراج DNA الجينومية من سلالات الخميرة، اثنان منها ترميز النوع البري كروموسوم 3 (النوع البري، synIXR 2)، في حين أن اثنين من رموز كروموسوم اصطناعي المتبقية 3 (synIII 1، synIII synIXR). تم الاستغناء QPCR مزيج الرئيسي في كل بئر من 1536 لوحة multiwell باستخدام موزع السائل بالجملة، تليها gDNA وPCRTag الاشعال باستخدام الاشعال صدى 550. تم المحتشدة مماثل فيكل رباعي من لوحة multiwell للمقارنة بصرية سهلة. ثم ختم الحرارة لوحة multiwell مع ختم واضح بصريا وتخضع في الوقت الحقيقي تحليل PCR. في هذه التجربة qPCRTag لاحظنا، بالنسبة للجزء الأكبر، والتضخيم، كما هو متوقع، حيث الاشعال الاصطناعية تضخيم حصرا DNA الاصطناعية والعكس بالعكس (أرقام 2 و 3). ومع ذلك، ونحن أيضا لاحظ العديد من الانحرافات من النمط المتوقع، مما يشير إلى السلبيات الكاذبة والمغلوطة في ورقة العمل. في هذه التجربة، تم الكشف عن التحكم الرئيسية في 100٪ من الآبار، مما يدل على موزع السائل بالجملة الاستغناء بنجاح mastermix في كل جانب على لوحة (لا تظهر البيانات). هذا يستبعد احد مصدرا محتملا للسلبيات واهية. بالإضافة إلى ذلك، ومن المعروف أن بعض كروموسوم 3 PCRTags أن تفشل (كما هو موضح في الشكلين S6 و S7 من Annaluru آخرون 1)، بما في ذلك على الأقل 2 SYN و 1 WTأزواج التمهيدي. وبالتالي يمكن تجاهل هذه الآبار في كل رباعي. السلبيات كاذبة حقيقية يمكن أن تنشأ من نقص في نقل قالب gDNA أو الاشعال، ولكن في تجربتنا، نظرا لمعايرة الصحيحة للصدى 550 وكذلك إعداد gDNA والاشعال كما وصفها، لم يكن هذا مصدرا رئيسيا للخطأ. عموما في هذه التجربة كان معدل سلبي كاذبة منخفضة للغاية لالاشعال WT مع قالب WT (~ 2٪) على الرغم من أعلى إلى حد ما عن الاشعال SYN مع SYN الحمض النووي (~ 8٪). ايجابيات كاذبة، والكشف عن إشارة في الآبار حيث يتم خلط الاشعال SYN مع WT gDNA (والعكس بالعكس)، يمكن أن تنشأ عن التضخيم أو عبر dimers التمهيدي. في الواقع، dimers التمهيدي وغالبا ما تكون مرئية من قبل الكهربائي للهلام (الشكل 1B) وتمثل مصدرا معقول من الخطأ. لتطبيق QPCR، وفحص منحنيات ذوبان يمكن أن تكون مفيدة لتحديد ما إذا كانت أنواع مختلفة، مثل dimers التمهيدي، قد تسهم في إشارة. وعلاوة على ذلك، الأداء الإقتصادي الأداءorming تجربة السيطرة حيث يتم الاستغناء الاشعال في غياب قالب الحمض النووي قد تساعد في تحديد الاشعال مع الميل إلى dimerize. التضخيم عبر ويمكن ملاحظة من قبل الكهربائي للهلام، ولا سيما إذا يتم تنفيذ العديد من دورات PCR أو إذا كانت درجة الحرارة الصلب منخفض جدا. حاولنا التقليل من عدد من ايجابيات كاذبة بسبب التضخيم عبر طريق تحسين كل من هذه المعلمات لبروتوكول qPCRTag. أخيرا، النظر في معبر (اف ب) القيم لكل بئر يمكن أن تساعد في تحديد الاشعال التي لا تتناسب مع الكشف على أساس الوقت الحقيقي (الشكل 3، على سبيل المثال، BB22، Fb22، Bb46، Fb46). عموما في هذه التجربة كان معدل ايجابية كاذبة منخفضة لالاشعال SYN مع قالب WT (~ 5٪) وأعلى لالاشعال WT مع قالب SYN (~ 10٪). الشكل 2: لوحة خريطة الحرارة التي تظهر وجود / ABدعوة العمالي لتجربة qPCRTag أربعة أنواع مختلفة من الحمض النووي الجيني (الأرباع مفصولة خطوط بيضاء صلبة) تعرضوا للتحليل PCRTag باستخدام الاصطناعية (SYN) والنوع البري (WT) كروموسوم 3 الاشعال PCRTag (متقطع خطوط بيضاء لفصل SYN (أعلى ) وWT (القاع) في كل رباعي). WT وsynIXR gDNA ترميز النوع البري كروموسوم 3، مما أسفر عن تضخيم مع الاشعال WT PCRTag. synIII وsynIII synIXR gDNA ترميز كروموسوم اصطناعي 3، مما أسفر عن تضخيم مع الاشعال SYN PCRTag. والمحتشدة الاشعال وفقا لمن اليسار إلى اليمين المواقع الكروموسومات ووضع مماثل في الأرباع الأربعة للمقارنة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 3: حرارة اللوحةخريطة تبين معبر (اف ب) قيمة لتجربة qPCRTag، وهذا هو نفس مجموعة البيانات كما في الشكل (2) وتخطيط لوحة بالتالي فهو متطابقة. N / A يشير إلى "عدم التضخيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

التأسيس في الوقت الحقيقي الكشف PCR في التنميط الجيني فحص PCRTag هو تطور مهم للمشروع Sc2.0، لأنها تتيح أعلى بكثير الإنتاجية. سير العمل السابق المحدد 2.5 ميكرولتر ردود الفعل في 384 لوحات PCR بشكل جيد، 1.5 ساعة الوقت الحراري المدى ركوب الدراجات، الاغاروز الكهربائي للهلام، والشرح المختصر من هلام.

سير العمل المعروضة هنا، ودعا تحليل qPCRTag، يتغلب على العديد من العقبات الرئيسية. أولا، تشغيل qPCRTag يتكثف 4 × 384 لوحات جيدة في تجربة واحدة التي يمكن معالجتها، البداية وحتى النهاية (لوحة انشاء بالإضافة إلى تشغيل الوقت)، في حوالي ساعة. ومن المهم أن نلاحظ أن تكلفة كاشف لكل بئر لتحليل qPCRTag على قدم المساواة مع النهج القائم على هلام الاغاروز الخرج أقل. ومع ذلك، من خلال التحايل الكهربائي جل والشرح اليدوي، وسير العمل qPCRTag يتيح تحقيق وفورات كبيرة في الوقت والعمل، والتي هي أهم مزايا. الأهم سير العمل qPCRTag هو ENمتوافق مع tirely الأتمتة.

ومصدر القلق الرئيسي مع استخدام الكشف في الوقت الحقيقي والإخراج للمقايسة PCRTag هو معدل كاذبة ايجابيات وسلبيات كاذبة. منذ الاشعال PCRTag لم تكن مصممة أصلا للاستخدام في الوقت الحقيقي PCR، فمن المتوقع أن ليس كل أزواج التمهيدي سوف تكون مناسبة للاستخدام مع هذا الناتج. تحقيقا لهذه الغاية من المهم التحقق من صحة وظيفة وخصوصية جميع أزواج التمهيدي PCRTag استبعاد فرعية التي لا تعمل في مقايسة على أساس الوقت الحقيقي في خط الهجوم. على سبيل المثال، كروموسوم 3 PCRTag كاذبة ايجابيات وسلبيات هي كل وكبيرة استنساخه في الوقت الحقيقي البيانات PCR (أرقام 2 و 3) وهذه يمكن استبعادها من إجراء المزيد من التحليلات. وعلاوة على ذلك، أزواج التمهيدي المعروف أن تفشل (المقررة من قبل الكهربائي للهلام ويظهر في أرقام S6 و S7 من Annaluru آخرون ¹⁾ يمكن أن تستبعد أيضا. ويتم إنجاز هذا بسهولة ببساطة excluقرع أزواج التمهيدي الخاطئة عند إعداد بروتوكول نقل الصوت.

مثل معظم فحوصات إنتاجية عالية، ونحن نعتزم استخدام الوقت الحقيقي كشف PCRTag كشاشة الأولية لتحديد transformants التي تستحق مزيدا من التحقق من صحة المصب. وفي وقت لاحق، فإن المعيار الذهبي لفحص ثانوي تبقى تحليل PCRTag مع هلام الكهربائي كما قراءات. ما وراء تطبيق تحليل PCRTag لSc2.0، والجمع بين دولة من بين الفن أنظمة مناولة النانو السائل مع إنتاجية عالية في الوقت الحقيقي تكنولوجيا PCR تمكن من تحليل السريع والآلي، ولها القدرة على التأثير العديد من المجالات. على سبيل المثال، يمكن تطبيق هذا العمل إلى ارتفاع الإنتاجية فحص مكتبة، تشخيص الأمراض المعدية، وتحليل microbiome، والمتطورة الجينوم التحرير النهج محاولة لتعديل مواضع متعددة في وقت واحد.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل في جزء من المؤسسة الوطنية للعلوم منح MCB-0718846 وزير الدفاع وكالة مشاريع البحوث المتقدمة العقد N66001-12-C-4020 (لمجلس الدفاع المشترك). وقد تم تمويل LAM من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا. برعاية نشر هذا المقال من قبل شركة روش.

Materials

			Yeast gDNA prep
yeast gDNA	custom	custom	template for real time PCR
Acid-washed glass beads (0.5mm)	Sigma	G8772	yeast cell lysis
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)	Invitrogen	15593-031	yeast cell lysis
5432 Mixer	Eppendorf	5432	yeast cell lysis
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807	yeast cell lysis
Qubit 3.0 Fluorometer	Life Technologies	Q33216	gDNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Life Technologies	Q32850	gDNA quantification
Labcyte 384PP plate	Labcyte	P-05525	gDNA source plate

			DNA Green Mastermix prep and dispensing
LightCycler 1536 DNA Green	Roche	5573092001	real time PCR mastermix
1.5mL Microfuge Tube Holder	ARI	EST BD060314-1	microfuge tube holder for deck of Cobra
LightCycler 1536 Multiwell Plate	Roche	5358639001
Cobra liquid handling system	Art Robbins Instruments	630-1000-10	dispense qPCR master mix into 1536 plate
PCR Plate Spinner	VWR	89184-608	cenrifugation of 1536 plate

			Template and primer dispensing
PCRTag primers	IDT	custom	premixed forward and reverse, [50uM] each
TempPlate pierceable sealing foil, sterile	USA Scientific	2923-0110	temporary seal for PCRTag primer plates
Labcyte LDV 384 well plate	Labcyte	LP-0200	pre-mixed primer source plate
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte		transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate
Plateloc Thermal Microplate Sealer	Agilent	G5402-90001	heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run
Clear Permanent Seal	Agilent	24212-001	optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage	Agilent	G5402-20008	can substitute ~2mm thick washers
Sorvall Legend XTR	Thermo Scientfic	75-004-521	centrifuge heat sealed 1536 plate
Industrial Air Compressor	Jun Air	1795011	to run the Echo and Heat Sealer

			Real Time PCR
LightCycler 1536	Roche		requires 220V outlet

Referencias

Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344 (6179), 55-58 (2014).
Dymond, J. S., et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).
Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-547 (1996).
Dymond, J., Boeke, J. The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization. Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).
Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).
Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. Design-A-Gene with GeneDesign. Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).
Lajoie, M. J., et al. Probing the limits of genetic recoding in essential genes. Science. 342 (6156), 361-363 (2013).
Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast. Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).
Dymond, J. S. Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).
Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis – A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).