qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Leslie A. Mitchell; Nick A. Phillips; Andrea Lafont; James A. Martin; Rupal Cutting; Jef D. Boeke

doi:10.3791/52941

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biología

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

Published: May 25, 2015

doi:

10.3791/52941

Leslie A. Mitchell¹, Nick A. Phillips¹, Andrea Lafont², James A. Martin¹, Rupal Cutting², Jef D. Boeke¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,Institute for Systems Genetics, ²Roche Life Science, USA

Summary

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Abstract

Sentetik Maya Genom Projesi (Sc2.0) 16 tasarımcı maya kromozom oluşturmak ve tek bir maya hücresi bunları birleştirmeyi amaçlamaktadır. Tek sentetik kromozomu, synIII ^1, ve bir sentetik kromozom kolu, synIXR ² Bugüne kadar inşa ve in vivo fonksiyon gelen vahşi tip kromozom yokluğunda onaylanmıştır. Sc2.0 kromozomların önemli tasarım özelliği kendi vahşi tip muadilleri sentetik kromozom farklılaşmasını sağlayan açık okuma çerçeveleri (ORF) kapsamında kısa, yeniden kodlanmış dizileri olan PCRTags, giriştir. PCRTag, sentetik ya da vahşi tip kromozom ve basit bir PCR tahlili kullanılarak test edilebilir DNA her tür varlığı / yokluğu birine seçici olarak yeniden birleşir primerleri. PCRTag tahlilin standart okuma agaroz jel elektroforezi ile amplikonların varlığını / yokluğunu değerlendirmektir. Ancak, 1.5 kb ve ag başına bir ortalama PCRTag amplikon yoğunluğu ile~ 12 Mb enome boyutu tamamlanmış Sc2.0 genomu yaklaşık 8.000 PCRTags kodlamak. Verimlilik artırmak için, biz qPCRTag analizi diyoruz PCRTag genotipleme için gerçek zamanlı PCR-tabanlı algılama tahlil geliştirdik. İş akışı bize tek bir deneyde, sentetik ve yabani tip primer çiftleri hem 768 PCRTags kadar test etmenize olanak sağlayarak, bir 1.536 multiwell plaka 500 nl reaksiyonları belirtir.

Introduction

Sc2.0 veya Sentetik Maya Genom Projesi ( www.syntheticyeast.org ), tasarımı ve tamamen sentetik ökaryotik genom inşa hedefini belirledi. Bir başlangıç noktası olarak Saccharomyces cerevisiae ³ derece küratörlüğünü genom dizisi kullanarak, onaltı doğrusal kromozomların her biri, hücre zindeliği korumak genom istikrarı geliştirmek ve genetik esnekliğinin artırılması belirttiğiniz tasarım ilkeleri bir dizi karşılamak üzere yeniden tasarlandı. Örneğin, bu gibi tekrarlar olarak destabilize edici elemanlar Sc2.0 kromozom silinir. TAG durdurma kodonunun tüm örnekleri olmayan bir genetik olarak kodlanan amino asidin sokulması için son suşunda bir kodon 'serbest' TAA yeniden kodlanır. Ayrıca Cre-lox sistemi tarafından etkin bir uyarılabilir evrim sistemi, Scramble, yeni yapılar ⁴ türev genomları üretmek için benzersiz kapasite sağlar.

<p class="Jove_content"> Sc2.0 genomunda başka önemli tasarım öğesi, sentetik ve yabani tip DNA izlemeyi etkinleştirmek için DNA filigran olarak hizmet PCRTags, giriştir. PCRTags sentetik kromozom üzerinde ORF kısa, yeniden kodlanmış segmentler; PCRTag sekansları sentetik, vahşi tip kromozom arasında, DNA seviyesinde farklılık ise, kodlanan proteinlerin amino asit dizisi ve bu nedenle, muhtemelen, işlev olarak aynıdır. PCRTag sekansları, özellikle, seçici amplifikasyon (Şekil 1A) kolaylaştırmak için primer bağlanma bölgeleri olarak tasarlanmıştır. PCRTag tasarımı, tipik olarak 58 ° C ile 60 ° C arasında erime sıcaklıkları olan, doğal dizilerden (en az% 33) daha ~ 60% farklı olan sentetik sekanslar Recoded, sonuçta GeneDesign ^5,6 'en farklı' algoritması kullanılarak gerçekleştirilmektedir amplikonu 200-500 baz çifti ² arasında uzunlukları. Bu bölgeler bildiği gibi Recoding her ORF ilk 100 bp mesafede izin verilmezkodon kullanımının ⁷ bakımından özel tercihleri vardır. Birlikte, bu tasarım kuralları, sentetik ve yabani tip PCRTag primer çiftleri sadece sentetik ve doğal DNA sırasıyla (Şekil 1B) bağlamak ve yükseltmek sayede PCR koşulları tek bir set altında hemen hemen tüm PCRTags yüksek performansını tercih.

Şekil 1:. PCRTag şematik bir (A), PCRTags Sc2.0 genlerin kromozomlar üzerindeki açık okuma çerçeveleri (ORF) içindeki dizileri yeniden kodlanır. (B) Sentetik (sin) ve yabani tip (WT) PCRTag primerler özel olarak ise, bağlanma ve (gDNA), sentetik ve yabani tip genomik DNA'yı büyütmek. Şablon olarak WT veya yarı synVIL2 gDNA kullanarak onüç PCRTag primer çiftleri test kromozomun altı sol kolunun bir ~ 30 kb segmentinde bir analizi, burada gösterilmektedir. Pek çok durumda, tek bir ORF birden fazla P kodlayanCRTag. PCRTag amplikonlarının varlığı / yokluğu agaroz jel elektroforez ile değerlendirilir. PCRTag amplikonlar 200 bp ila 500 bp uzunluğundadır. Panellerin alt kısmında hızlı göç türler astar dimerleri bulunmaktadır.

PCRTag analizi Sc2.0 kromozomların mecliste önemli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. 20-30 PCRTags kodlayan sentetik bir DNA Tipik bir deneyde, 30-50 kb, olarak, karşılık gelen vahşi tip DNA ^1,2,8 yerine, maya hücreleri içine transforme edilir. PCRTag analizi daha sonra DNA bu segmenti kapsayan sentetik değil vahşi tip PCRTags kodlayan transformantların tanımlamak için kullanılan, ya da 'kazananlar' olarak adlandırılan. Bu 'kazananları' belirlemek, böylece throughput ve PCRTag analizi maliyeti önemli hususlar şunlardır birden fazla transformantların test genellikle gereklidir. Şu anda iki Sc2.0 kromozom Sc2.0 genomunun% 10'dan az temsil (synIII ¹ ve synIXR ²⁾ tamamlanmış, although fazla kalan kromozomların yarısı halen sentezini ve montaj geçiyor. Bu proje için gerekli PCRTag analizi ölçeği, hızlı, sentetik DNA ve yabani tip DNA varlığı veya yokluğunun jeller manuel olarak çalıştırmak ve skor yeteneği aşmıştır.

Biz agaroz jel elektroforezi kullanımını engelleyecek şekilde gerçek zamanlı PCR kullanarak bir iş akışı geliştirdik PCRTag tahlil verimini artırmak için. iş akışı 1536 çok oyuklu bir plaka, şablon DNA ve primerler aktarmak için bir nano ölçekli akustik bir sıvı dağıtıcı her oyuğuna qPCR MasterMix dağıtmak için bir sıvı kimyasal dağıtıcı kullanan ve 1536 qPCR termal döngü cihazı, bize 500 nl tepkileri küçültmek izin veren ve verimi en üst düzeye çıkarmak. Ayrıca analiz otomatik hale getirilebilir. Yüksek verimlilik Genotipleme protokolünün Bu tip çoklu loci birçok klonlarının analizi gerektiren herhangi bir proje için genellenebilir olması gerekir.

Protocol

1. (gDNA) Maya genomik DNA hazırlamak 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl,% 1 SDS içeren maya Liziz Tamponu 9 bir stok hazırlanması (a / h),% 2 Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA, pH 8.0. Tipik BY4741 10 arka plan laboratuar suşları için doymuş kültür 100 ~ için ul karşılık malzeme kullanımı ~ 2 x 10 6 hücre, başlangıç olarak. Kültürlenmiş hücreler, bir 1.5 ml mikrofüj tüpe, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile toplanabilir. Süpernatant aspire. Maya Liziz Tampon 200 ul ekleyin ve pipetleme hücre pelletini. Asit tanelerin seviyesinin, hücre harç seviyesinin altında yaklaşık 1 mm olacak şekilde cam boncuklar yıkanmış ~ 300 ul ekle. Bir çeker ocak içinde izoamil alkol, fenol / kloroform ve 200 ul / ekleme (25: 24: 1). Mikrofuge'ye tüp kap ve bu çalkalama sırasında sızıntı neden olur hiçbir boncuk başlık ve tüp arasında sıkışmış sağlamak(Adım 1.6). Mix ve kapağının sızdırmaz olduğundan emin olmak için 3 kez ters çevirin. Bu tür bir Eppendorf 5432 bir tezgah üstü mikser kullanılarak, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile boru çalkalayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,800 x g'de santrifüjleyin. Aktarım,% 100 etanol içinde 1 ml içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne sulu fazın 75 ul. Karıştırmak için 10 kez ters çevirin. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20,800 x g'de santrifüj ile DNA pelleti. DNA pelet yerinden oynatmamaya olmadan süpernatant aspire. % 70 etanol içinde 500 ul ile pelet yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 20,800 x g'de santrifüjleyin. DNA pelet yerinden oynatmamaya ve genellikle yaklaşık 10 dk fazla etanol çekinceye kadar açık mikrofuge'de kapağı ile pelet hava kurumasına olmadan süpernatant aspire. 75 10 mM Tris, pH 7.4 ul ve karıştırmak için vorteks DNA pelletini. Belirsiz bir süre -20 ° C'de örnek saklayın. Bir kullanılarak numunedeki DNA konsantrasyonu ölçümüRNA DNA ayıran qubit, gibi fluorimeter tezgah üzeri. GDNA son konsantrasyonu ~ 1-2 ng / ml olduğundan emin olun. Karıştırmak için su ve vorteks ile genomik DNA 1:10 seyreltme hazırlayın. Kısım nano ölçekli akustik bir sıvı dağıtıcı (aşama 3) ile uyumlu olan bir kaynak plakasının uygun kuyuya seyreltildi gDNA 30 ul. Bir Labcyte Echo 550 kullanıyorsanız, 384 polipropilen plaka (384PP plaka) kullanın. Not: uygun bir sızdırmaz zaman bu plaka, -20 ° C'de, en az bir ay depolanabilir. 2. 1.536 multiwell plaka içine hazırlayın ve Dağıtım qPCR Master Mix Karıştırmak için 1.5 ml mikrofuge'de tüp ve vorteks böyle LightCycler 1536 DNA Yeşil Master olarak QPCR ana karışımı 850 ul, hazırlayın. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için oda sıcaklığında 20.800 xg'de 2 dakika süreyle QPCR ana karışımı santrifüjleyin. Tek 1536 çok oyuklu bir plaka için gerekli qPCR ana karışımı bileşenleri aşağıdaki gibidirs: Enzim usta karışımı (konsantre Yeşil Usta Tüp 1, 5x), SYBR 42.5 ul (20x konsantre Yeşil Usta Tüp 4) 170 ul ve su 637,5 ul birleştirin. Dağıtın iyi böyle Sanat Robbins Cobra gibi dökme sıvı dağıtıcı kullanılarak 1.536 multiwell plaka içine / 500 nl. (2.2.1-2.2.4 Cobra özellikle atıfta adımları Not.) Aşağıdaki ayarlarla bir dağıtım programı oluşturun: Sıvı sınıf, su; aspirat hacmi 800 ul; hacim, 500 nl dağıtmak; süresi, 20 saniye yıkayın. Dağıtım ayarlarında, dağıtım hızı 49.6 mm / sn olarak ayarlanır doğrulayın ofset dağıtım 0,25 mm ve aşırı aspire sıvı de geri kaynağına reçete edilecektir. Mikrofuge'de tüp kapağını keserek ya da sadece açık bırakın güverte pozisyonunda 1. bulunur mikrofuge'de tüp tutucu, iyi A1 qPCR ana karışımı içeren mikrofuge'ye tüp yerleştirin. Aspirat düzenleyerek A1 'de aspire' SetE ayarları. Önce 'koşmak' vurmak sonra adım 2.2.2 kurmak programın ilk de-seçilmesi aspire ve dağıtmak adımlarla QPCR ana karışımı dağıtım ve bir yıkama adımı gerçekleştirmek. Tamamlandığında, aspire yeniden seçin ve qPCR ana karışımı dağıtmak için tam programını çalıştırmadan önce adımları dağıtmak. Cobra Başbakan sisteme hizmet veren az 10 dakika ilk yıkama aşaması, boşta oturan olmuşsa, gereksizdir. Her oyuğa QPCR ana karışımı dağıtmak için 'koşmak' vur. Iyi 1536 multiwell plaka (düşük hızda PCR plaka eğiren kullanarak 30 sn) kısa santrifüj her altındaki qPCR ana karışımı toplayın. 3. Dağıtım Şablon DNA ve 1.536 multiwell plaka içine Astarlar Böyle Echo 550 gibi bir akustik sıvı transferi sistemi kullanılarak 1536 multiwell plaka istenen kuyulara seyreltilmiş gDNA 5 nl (adım 1.3) koyun. Ech İçin550 o Plaka Reformat yazılımı kullanmak veya alternatif transferi programlamak için özel bir Excel sağlar. Program fiziksel gDNA (adım 1.3) dağıtılan sahip iyi içine kaynak eşleşir gDNA için iyi seçilmiş bir kaynak olun. 384PP plaka sıvı yüzey aktif olmayan bir tampon olduğunu gösterir kaynak plaka tipi '384PP_AQ_BP2' seçin. Primerler, öne doğru önceden karıştırılmış ve bu Echo 550 gibi bir akustik sıvı transfer sistemi kullanılarak 1536 çukurlu plakanın arzu edilen kuyulara 50 uM, her biri bir nihai konsantrasyona kadar tersine 10 NL koyun. Sıvı transfer sistemi için, Plaka Reformat yazılımı kullanmak veya alternatif transferi programlamak için özel bir Excel sağlar. NOT: Burada o kolay yani 1,536 multiwell plaka üzerinde düzeni görsel gerçek zamanlı PCR sonuçları incelemek için primerlerin kromozomal sırasını örtüşmesi şeklindedir primerler dağıtmak mümkündürDaha sonra (adım 6). Akustik bir sıvı dağıtıcısı ile uyumlu olan bir plaka primerleri karışımlar. Echo 550, bir Labcyte 384LDV (düşük ölü hacim) plaka kullanmak ve kaynak plaka tipi '384LDV_AQ_B' sıvı hiçbir proteinler ile basit bir tampon olduğunu göstermek için Yankı programlama seçin. 4. Mühür ve Santrifüj 1536 multiwell plaka Böyle Plateloc Termal Mikroplaka Sealer olarak bir mikroplaka mühürleyen sistemi kullanarak, hemen ısı mühürleyen cihazı ile uyumlu optik net mühür kullanılarak 1.536 çukurlu plaka mühür. Bulaşmaya işaretleri önlemek için mühür yüzeyine dokunmayın. Plateloc Termal Mikroplaka Sealer kullanıyorsanız, aşağıdaki ayarları kullanın: süresi 2.0 sn, mühür sıcaklığı 162 ° C, hava basıncı 82 psi mühür. Bu cihaz ısınmaya ~ 5 dakika sürer ve böylece önceden açık olmalıdır. Plateloc Termal Mikroplaka macunu kullanarak ise, adaptöR iyi bir sızdırmazlık sağlamak için bir araç aşamasında 1536 çukurlu plakanın yüksekliğini artırmak için kullanılmalıdır. NOT: Plateloc Termal Mikroplaka Sealer için Sahne Plate satın tercih olmakla birlikte, alternatif bir çözüm 1,536 multiwell plaka yüksekliğini artırmak için köşelere herhangi bir donanım mağazasında mevcut dört ~ 2 mm kalınlığında standart pulları eklemek etmektir. Hemen her bir altındaki tüm reaktifler toplamak için, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 2000 x g'de sızdırmaz 1536 çukurlu plaka santrifüj. 5. Real Time PCR Program, bir erime eğrisi analizine, ardından iki adımlı bir büyütme protokolüne böyle LightCycler 1536 olarak 1536 qPCR aleti. Aşağıdaki gibi LightCycler 1.536 yazılım programı kurmak kullanma: Ön inkübasyon: 95 ° C, 1 dakika tutun, rampa oranı 4.8 ° C / sn, hiçbir kazanım. İki Adım Büyütme: [95 ° C 30 döngü, hiçbir tutma,oranı 4.8 ° C / sn rampa, hiçbir kazanım; 64 ° C, 30 saniye tutun, rampa oranı 2.5 ° C / sn, tek edinme]. Eritin eğrisi: 95 ° C, 10 sn, rampa oranı 4.8 ° C / sn, hiçbir kazanım; 60 ° C, 1 dakika, rampa oranı 2.5 ° C / sn, herhangi bir satın alma; 97 ° C, rampa oranı 0.1 ° C / sn, 5 satın almalar / (sürekli) ° C. Serin: 40 ° C, 30 saniye, rampa oranı 2.5 ° C / sn, hiçbir kazanım. Run Tanımı sekmesinde "Yeşil intercalating Boya 'olarak algılama biçimi ayarlayın. Run Tanımı sekmesinde 'Master Control' için pipetleme kontrolünü ayarlayın. Bu özellik, bir iç kontrol olarak hizmet eder ve varsayımsal yanlış negatifler tespit etmek yararlıdır 1536 çok oyuklu bir plaka, her çukuruna qPCR ana karışımı varlığını kontrol eder. 1.536 QPCR aracı haline adımlarla 2-4 hazırlanan 1536 çukurlu plaka takın ve programı çalıştırın. 6. Veri Analizi PerfQPCR yazılım içinde verilerin görsel kontrol kapatýnýz. NOT: 1.536 yazılım hem amplifikasyon görüntülenmesini sağlayarak ve çağrısı (pozitif, negatif, geçersiz, N / A, Şekil 2) gösteren bir ısı haritası yanı sıra, eğriler eritin (pozitif ya da gri renk skalası sürgülü, geçiş noktası değeri Negatif için; Şekil 3), ya da bir bitiş noktası floresan (EPF) değeri () renk skalası kayar. Ham verilerden veya cihazdan çevrimdışı işleme için hesaplanan verilerde biriyle 1,536 formda Yazılım bir .txt dosyası (sonuç tablosu) veya .xml dosyası İhracat verileri. NOT: Yüksek güven ile olumlu / olumsuz ve Cp değeri aramaları belirlerken 1.536 yazılımı yerleşik özel otomatik geçiş noktası (Cp) çağıran algoritması nispeten düşük düşük alt mikrolitre reaksiyon hacimlerinde dikkate şekil ve amplifikasyon eğrisinin eğimini alır floresan değerleri. LightCycler DNA Yeşil Usta kullanımı iseqPCR d, tüm kuyuları 'master kontrol' geçti doğrulayın. Bir fail de qPCR ana karışımı ve eksik veri noktası potansiyel bir yanlış negatif kabul edilmelidir almadı gösterir. Tüm kuyuları 'master kontrol' geçti doğrulayın. Bir fail de DNA MasterMix almak ve eksik veri noktası potansiyel bir yanlış negatif dikkate almadı gösterir.

Representative Results

Biz dört farklı suşları çıkarılan maya genomik DNA (gDNA) sentetik ve yabani tip kromozom 3 PCRTag primer çiftleri 1 test ettik. Kromozom 3 kromozomun uzunluğu yayılan 186 PCRTag primer çiftleri (synIII olduğunu ~ 270 kb ve yabani tip kromozom 3'tür ~ 315 kb) sahiptir. Her iki primer seti ile dört türünün her test etmek için, alt yarısı, her bir çeyrek daire üst yarısı ve vahşi tip sentetik PCRTag primerleri atama, dört çeyrek, gDNA her türü için içine oyuklu bir plaka ayrılmıştır. Genomik DNA, vahşi tip kromozom 3 (vahşi tip, synIXR 2) kodlayan ikisi maya cinsleri, elde edilen geri kalan iki kodlayan sentetik kromozom 3 (synIII 1, synIII synIXR) iletilir. QPCR ana karışımı olarak aynı şekilde düzenlenmiştir, Eko 550 primerleri kullanılarak gDNA ve PCRTag primerler ardından bir sıvı kimyasal dağıtıcı kullanan bir 1536 çukurlu bir levhanın her bir gözü içerisine edildikolay görsel karşılaştırma için multiwell plakanın her kadranda. çukurlu plaka daha sonra, optik bakımdan saydam bir conta ile sızdırmaz kılınmış ve gerçek zamanlı PCR analizine tabi ısı oldu. Beklendiği gibi, bu qPCRTag deneyde sentetik primerler özel olarak sentetik DNA ve tersi amplifiye sayede, büyük bir kısmı, amplifikasyonu için, gözlenen (Şekil 2 ve Şekil 3). Ancak, biz de veri kümesi içinde yanlış negatifler ve yanlış pozitif düşündüren, beklenen desen birkaç sapmalar görülmüştür. Bu deneyde, ana kontrol başarılı bir plaka üzerindeki her içine MasterMix tevzi dökme sıvı dağıtıcı gösteren kuyuların% 100 olarak tespit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu yanlış negatif bir potansiyel kaynak dışladı. Buna ek olarak, kromozom 3 PCRTags en az 2 sin ve 1 ağırlık dahil olmak üzere, (Şekil S6 gösterilen ve Annaluru et al S7. 1) başarısız bilinmektedirprimer çiftleri; dolayısıyla bu kuyular, her kadranda göz ardı edilebilir. Doğru yanlış negatifler doğru Echo 550 kalibrasyon yanı sıra gDNA hazırlanması ve tarif edildiği gibi primerler verilen, deneyimlerimiz, ancak şablon gDNA'sından veya primer transferi eksikliğinden ortaya çıkabilecek, bu hatanın önemli bir kaynak olmamıştır. Genel olarak, bu deneyde, yanlış negatif oran WT şablonu (~% 2), syn-DNA (~% 8) ile SYN primerler için biraz daha yüksek olmasına rağmen wt primerler için son derece düşüktü. Yanlış pozitif, SYN primerleri WT gDNA (ve tersi) ile karıştırılır kuyularda sinyalin tespiti, çapraz büyütme veya primer dimerleri ortaya çıkabilir. Nitekim, astar dimerleri jel elektroforezi (Şekil 1B) tarafından sıklıkla görülebilir ve hata makul bir kaynak oluşturmaktadır. QPCR uygulanması için, erimiş kitle eğrileri incelenmesi Bu primer dimerler olarak, farklı türlerin, bir sinyale katkıda edilebilir olup olmadığını belirlemek için yararlı olabilir. Bundan başka, perfprimerler dimerize etme eğiliminde olan primerler teşhis edilmesine yardımcı olabilir şablon DNA yokluğunda tevzi sayede bir kontrol deneyini oluşturmayan. Çok sayıda PCR döngüsü gerçekleştirilir veya tavlama sıcaklığı çok düşükse çapraz amplifikasyonu, özellikle de jel elektroforezi ile gözlenebilmektedir. Biz qPCRTag protokolü için bu parametrelerin ikisi optimize ederek nedeniyle çapraz amplifikasyon yanlış pozitiflerin sayısını en aza indirmek için çalıştık. Son olarak, gerçek zamanlı tabanlı algılama için uygun değildir primerler belirlemenize yardımcı olabilir her iyi için geçiş noktası (Cp) değerlerini inceleyerek (örn Şekil 3, BB22, Fb22, Bb46, Fb46). Genel olarak bu deneyde yanlış pozitif oran SYN şablonu (~% 10) ile WT primerleri WT şablonu (~% 5) ve daha yüksek olan SYN primerler için düşüktür. Şekil 2: varlığı / ab görüntüleyen Plakalı ısı haritasıBir qPCRTag deney için sense arama. SYN ayırmak için, beyaz kesikli çizgiler genomik DNA (kadran beyaz katı çizgiler ile ayrılmış) sentetik (sin) kullanılarak PCRTag analizine tabi tutulmuştur ve vahşi tip (WT) kromozom 3 PCRTag primerleri (dört farklı (üst Her kadranda) ve WT (alt)). WT ve synIXR gDNA. SynIII ve synIII synIXR gDNA SYN PCRTag primerleri ile PCR amplifikasyonu elde edilmiştir sentetik kromozom 3 şifreleyen WT PCRTag primerleri ile PCR amplifikasyonu elde edilmiştir, vahşi tip kromozom 3 kodlar. Astarlar kendi sol-sağ kromozomal konumlandırma göre dizilmiş ve karşılaştırma için dört kadranda aynı konumlandırılmış. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3: Plakalı ısıBir qPCRTag deney için geçiş noktası (CP) değeri gösteren haritası., Şekil 2 ile aynı veri seti ve plaka yerleşimi dolayısıyla aynıdır. N / A 'hayır amplifikasyon' anlamına gelir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Önemli ölçüde daha yüksek verim sağlar gibi PCRTag genotiplemesi tahlil içine gerçek zamanlı PCR algılama Kuruluş Sc2.0 projesi için önemli bir gelişmedir. Bir önceki iş akışı 384 gözlü PCR plakaları, 1.5 saat termal döngü çalışma süresi, agaroz jel elektroforezi ve jel manuel açıklama 2.5 ul reaksiyonlar belirtilmiş.

qPCRTag analizi olarak adlandırılan Burada sunulan iş akışı, birkaç büyük darboğazlar üstesinden gelir. İlk olarak, bir qPCRTag çalıştırmak yaklaşık bir saat içinde bitirmek (plaka kurmak artı çalışma süresi) başlar, işlenebilir tek bir deney haline 4 x 384 kuyucuğu yoğunlaşır. Bu qPCRTag analizi için kuyu başına reaktif maliyeti daha düşük verim agaroz jel bazlı yaklaşımla eşit olduğuna dikkat etmek önemlidir. Ancak, jel elektroforezi ve manuel şerhi engellemeyi, qPCRTag iş akışı önemli avantajları zaman ve emek önemli tasarruf, tanıyor. Önemlisi qPCRTag iş akışı tr olduğunuotomasyon ile uyumlu yollarla ortaya çıktığı tam.

PCRTag tahlilinde çıktısı olarak gerçek zamanlı saptama kullanımı ile büyük bir endişe yanlış pozitif ve yanlış negatif oran. PCRTag primerler başlangıçta gerçek zamanlı PCR kullanılmak üzere tasarlanmamıştır olduğundan, tüm primer çiftleri, bu çıkışı ile kullanım için uygun olması beklenmektedir. Bu amaçla, ön gerçek zaman bazlı bir deneyde çalışmaz alt kümesini tutmak için tüm PCRTag primer çiftleri fonksiyonu ve özelliğini doğrulamak için önemlidir. Örneğin, kromozom 3 PCRTag yanlış pozitif ve negatif olan by-ve-large PCR verileri (Şekil 2 ve 3) gerçek zamanlı olarak tekrarlanabilir ve bu diğer analizler dışında olabilir. Dahası, başarısız olduğu bilinmektedir primer çiftleri (jel elektroforezi ile değerlendirildi ve Şekiller S6 ve ark. ¹ Annaluru arasında S7 gösterilen) de dahil edilebilir. Bu kolayca etkili olmuştur basit yapılırding akustik transfer protokolü hatalı primer çiftleri kurarken.

En yüksek kapasiteli deneyleri gibi, biz daha fazla aşağı doğrulama hak transformantların belirlemek için birincil ekran olarak gerçek zamanlı PCRTag algılama kullanmak niyetinde. Daha sonra, ikincil tarama için altın standart okuma olarak jel elektroforezi ile PCRTag analizi kalacaktır. Yüksek verimlilik, gerçek zamanlı PCR teknolojisi ile state-of-the-art nano sıvı taşıma sistemleri birleştirerek Sc2.0 için PCRTag analizi uygulaması, ötesinde hızlı ve otomatik analiz sağlar ve birçok alanda etkileme potansiyeline sahiptir. Örneğin, bu iş akışı yüksek kapasiteli kütüphane taraması, bulaşıcı hastalık tanısı, mikrobiyomları analizi ve üstün genom düzenleme uygulanan olabilir aynı anda birden fazla lokus değiştirmeye teşebbüs yaklaşımları.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen desteklenen Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-0718846 ve (JDB kadar) Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı Sözleşme N66001-12-C-4020. LAM Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi doktora sonrası bursu tarafından finanse edildi. Bu yazının yayınlanması Roche tarafından desteklenmektedir.

Materials

			Yeast gDNA prep
yeast gDNA	custom	custom	template for real time PCR
Acid-washed glass beads (0.5mm)	Sigma	G8772	yeast cell lysis
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)	Invitrogen	15593-031	yeast cell lysis
5432 Mixer	Eppendorf	5432	yeast cell lysis
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807	yeast cell lysis
Qubit 3.0 Fluorometer	Life Technologies	Q33216	gDNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Life Technologies	Q32850	gDNA quantification
Labcyte 384PP plate	Labcyte	P-05525	gDNA source plate

			DNA Green Mastermix prep and dispensing
LightCycler 1536 DNA Green	Roche	5573092001	real time PCR mastermix
1.5mL Microfuge Tube Holder	ARI	EST BD060314-1	microfuge tube holder for deck of Cobra
LightCycler 1536 Multiwell Plate	Roche	5358639001
Cobra liquid handling system	Art Robbins Instruments	630-1000-10	dispense qPCR master mix into 1536 plate
PCR Plate Spinner	VWR	89184-608	cenrifugation of 1536 plate

			Template and primer dispensing
PCRTag primers	IDT	custom	premixed forward and reverse, [50uM] each
TempPlate pierceable sealing foil, sterile	USA Scientific	2923-0110	temporary seal for PCRTag primer plates
Labcyte LDV 384 well plate	Labcyte	LP-0200	pre-mixed primer source plate
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte		transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate
Plateloc Thermal Microplate Sealer	Agilent	G5402-90001	heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run
Clear Permanent Seal	Agilent	24212-001	optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage	Agilent	G5402-20008	can substitute ~2mm thick washers
Sorvall Legend XTR	Thermo Scientfic	75-004-521	centrifuge heat sealed 1536 plate
Industrial Air Compressor	Jun Air	1795011	to run the Echo and Heat Sealer

			Real Time PCR
LightCycler 1536	Roche		requires 220V outlet

Referencias

Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344 (6179), 55-58 (2014).
Dymond, J. S., et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).
Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-547 (1996).
Dymond, J., Boeke, J. The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization. Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).
Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).
Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. Design-A-Gene with GeneDesign. Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).
Lajoie, M. J., et al. Probing the limits of genetic recoding in essential genes. Science. 342 (6156), 361-363 (2013).
Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast. Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).
Dymond, J. S. Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).
Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis – A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).