qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Leslie A. Mitchell; Nick A. Phillips; Andrea Lafont; James A. Martin; Rupal Cutting; Jef D. Boeke

doi:10.3791/52941

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Biología

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

Published: May 25, 2015

doi:

10.3791/52941

Leslie A. Mitchell¹, Nick A. Phillips¹, Andrea Lafont², James A. Martin¹, Rupal Cutting², Jef D. Boeke¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,Institute for Systems Genetics, ²Roche Life Science, USA

Summary

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Abstract

합성 효모 게놈 프로젝트 (Sc2.0)는 16 디자이너 효모 염색체를 구축하고 하나의 효모 세포로 결합하는 것을 목표로하고있다. 하나 합성 염색체 synIII ^1, 및 하나의 합성 염색체 팔 synIXR ^2를 지금까지 구성 및 그 생체 기능은 대응 야생형 염색체의 부재 하에서 검증되었다. Sc2.0 염색체의 중요한 설계 특징은 야생형 대응에서 합성 염색체의 차별화를 가능하게 오픈 리딩 프레임 (ORF를) 내 짧은, 재 코딩 시퀀스입니다 PCRTags의 도입이다. PCRTag 합성 또는 야생형 염색체 간단한 PCR 분석을 사용하여 테스트 할 수있는 DNA의 각 유형의 존재 / 부재 중 하나에 선택적으로 어닐링 프라이머. PCRTag 분석의 표준 판독 아가 로스 겔 전기 영동하여 증폭 산물의 존재 / 부재를 평가하는 것이다. 그러나, 1.5 킬로바이트 및 AG 당 하나의 평균 PCRTag 증폭 물 밀도~ 12 메가의 enome 크기는 완성 된 Sc2.0 게놈은 약 8,000 PCRTags를 인코딩합니다. 처리량을 개선하기 위해, 우리는 우리가 qPCRTag 분석 전화 PCRTag의 유전자형에 대한 실시간 PCR 기반 탐지 분석을 개발했습니다. 워크 플로는 우리가 하나의 실험에서 합성 및 야생형 프라이머 쌍 모두 768 PCRTags까지 테스트 할 수 있도록, 1536 멀티 웰 플레이트에서 500 NL 반응을 지정합니다.

Introduction

Sc2.0, 또는 합성 효모 게놈 프로젝트 ( www.syntheticyeast.org은 ), 설계 및 완전히 합성 진핵 생물의 게놈을 구축하는 목표를 설정하고있다. 출발점으로 사카 cerevisiae의 ³ 고도로 큐레이터 게놈 서열을 사용하여, 열 여섯 선형 염색체 각 셀 체력을 유지 게놈 안정성을 향상, 유전 유연성을 증가 지정 설계 원칙들의 세트를 충족시키기 위해 재 설계되었다. 예를 들어, 반복 등의 불안 요소는 Sc2.0 염색체에서 삭제됩니다. TAG 정지 코돈의 모든 인스턴스는 비 – 유전 학적으로 인코딩 된 아미노산의 도입에 대한 최종적인 균주의 코돈 '확보'를 TAA로 재 부호화된다. 또한 Cre 호텔-LOX 시스템에 의해 활성화 유도 진화 시스템, 스크램블은, 새로운 구조 ⁴ 파생 게놈을 생성하는 전례없는 능력을 허용한다.

<p class="jove_content는"> Sc2.0 게놈의 또 다른 주요 디자인 요소 합성 및 야생형 DNA의 추적을 가능하게 DNA 워터 마크 역할을 PCRTags의 도입이다. PCRTags 합성 염색체에 ORF를 짧은, 다시 코드 세그먼트이다; PCRTag 서열은 합성 및 야생형 염색체 DNA 간의 레벨 차이가있는 동안, 인코딩 된 단백질은 아미노산 서열, 따라서 아마도, 기능면에서 동일하다. PCRTag 시퀀스는 특히 선택적 증폭 (그림 1A)를 용이하게하기 위해 프라이머 결합 부위로 설계되어 있습니다. PCRTag 설계는 일반적으로 58 ° C, 60 ° C 사이 융점과 원시 시퀀스 (최소 33 %) 이상 ~ 60 % 다른 합성 서열을 코딩 수득 GeneDesign ^5,6-에서 '가장 다른'알고리즘을 이용하여 수행된다 앰플 리콘은 200 ~ 500 염기쌍 ² 사이의 길이. 이들 영역은 공지 된 바와 레코딩, 각 ORF의 처음 100 개의 염기쌍 내에 허용되지코돈 사용 ^(7)의 관점에서 특별한 설정을 가지고있다. 함께, 이러한 디자인 룰이 합성 및 야생형 PCRTag 프라이머 쌍 독점적 합성 및 천연 DNA 각각 (도 1b)를 결합하여 증폭함으로써 PCR 조건을 단일 조건에서 거의 모든 PCRTags의 고성능을 선호.

그림 1 :. PCRTag 설계도 () PCRTags는 Sc2.0 염색체에 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내에서 시퀀스를 다시 코딩. (나) 합성 (SYN) 및 야생형 (WT) PCRTag 프라이머는 독점적으로 각각 결합하여 (gDNA를)를 합성하고 야생형 게놈 DNA를 증폭. 템플릿으로 (WT) 또는 반 synVIL2 gDNA를 중 하나를 사용하여 열세 PCRTag 프라이머 쌍을 테스트 염색체 육의 왼쪽 팔의 ~ 30킬로바이트 세그먼트의 분석은, 여기에 표시됨. 많은 경우, 단일 ORF는 하나 이상의 P를 인코딩CRTag. PCRTag 앰플 리콘의 존재 / 부재가 아가 로스 겔 전기 영동을 통해 평가된다. PCRTag의 증폭은 200 BP 500 BP에 크기가 다양합니다. 패널의 맨 아래에있는 빠른 마이그레이션 종은 프라이머 이량 체이다.

PCRTag 분석 Sc2.0 염색체의 조립에 중요한 도구로 입증되었습니다. 20-30 PCRTags를 코딩하는 합성 DNA의 일반적인 실험 30-50킬로바이트에서는 대응 야생형 DNA ^1,2,8을 대체하는 효모 세포 내로 형질 전환된다. PCRTag 분석이어서 DNA의 세그먼트에 걸쳐 합성 아닌 야생형 형질 PCRTags 인코딩을 식별하는 데 사용되며, 또는 '승자 소위. 그것은 '승자'를 식별하므로 처리량과 PCRTag 분석의 비용이 중요한 고려 사항 여러 형질 전환을 테스트하는 것이 필요하다. 현재 두 Sc2.0 염색체가 Sc2.0 게놈의 10 % 미만을 나타내는 (synIII ¹ synIXR ²⁾ 완료되었는지, ALT무릎 더 남아있는 염색체의 절반 이상은 현재 합성 및 조립을 겪고있다. 이 프로젝트에 필요한 PCRTag 분석의 규모는 빠른 합성 DNA와 야생형 DNA의 부재의 존재를 젤을 실행하고 수동으로 득점 할 수있는 능력을 상회한다.

우리는 아가로 오스 겔 전기 영동의 사용을 회피하기 위해 실시간 PCR을 사용하여 흐름을 개발 PCRTag 분석의 처리량을 향상시킬 수있다. 워크 플로우는 1536 멀티 웰 플레이트, 주형 DNA와 프라이머를 전송하는 나노 탄성 액체 디스펜서의 각 웰에 qPCR에의 mastermix을 분배 벌크 액체 분배기를 사용한다, 그리고 1536 qPCR의 열 사이 클러는, 우리가 500 (NL)로 반응을 소형화 할 수 있도록하고 처리량을 극대화 할 수 있습니다. 또한 분석은 자동화 될 수있다. 높은 처리량 프로토콜의 유전자형이 유형은 여러 서식처에서 많은 클론의 분석을 요구하는 모든 프로젝트에 일반화 될 것이다.

Protocol

1. (gDNA를)를 효모 게놈 DNA를 준비 50 mM 트리스의 pH 8.0, 100 mM의 NaCl을, 1 % SDS를 포함 효모 용해 버퍼 (9)의 재고를 준비 (W / V), 2 % 트리톤 X-100 (V / V), 1 mM의 EDTA pH가 8.0. 일반적으로 BY4741 (10) 배경의 실험실 균주에 대한 포화 문화 100 ~에 μl를 해당 재료 사용 ~ 2 × 10 6 세포를 시작으로. 배양 된 세포는 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브 내에서 실온에서 3 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리에 의해 수집한다. 뜨는을 대기음. 효모 용해 버퍼 200 μl를 추가하고 피펫으로 세포 펠렛을 resuspend. 산은 비드 레벨 셀 슬러리의 수준 아래 약 1mm가되도록 유리 비드의 세정 ~ 300 μL를 추가한다. 흄 후드에서 이소 아밀 알코올, 페놀 / 클로로포름 200 μL / 추가 (: 24 : 25 1). 의 microfuge 튜브 캡이 떨고 동안 누수가 발생합니다 어떠한 비드 캡과 튜브 사이에 붙어 있지 않은지 확인(단계 1.6). 혼합하고 뚜껑이 밀봉되어 있는지 확인하기 위해 3 회 전환. 이러한 에펜 도르프 5432으로 탁상 믹서로 실온에서 10 분 동안 튜브를 흔들어. 4 ℃에서 10 분 동안 20,800 XG에 원심 분리기. 전송을 100 % 에탄올 1 ㎖를 함유하는 미세 원심 새로운 튜브에 수성상의 75 μL. 혼합을 10 회 전환. 4 ℃에서 20 분 동안 20,800 XG에서 원심 분리하여 DNA를 펠렛. DNA 펠렛을 빠지없이 뜨는을 대기음. 70 % 에탄올 500 μL로 펠렛을 씻으십시오. 4 ℃에서 5 분 동안 20,800 XG에 원심 분리기. DNA 펠렛을 빠지 일반적으로 약 10 분이다 초과 에탄올이 증발 될 때까지 개방의 microfuge 모자와 펠렛을 공기 – 건조하지 않고 뜨는을 대기음. 75 mM이 트리스 산도 7.4의 μL와 혼합하는 소용돌이의 DNA 펠렛을 재현 탁. 무기한 -20 ° C에서 샘플을 저장합니다. 을 사용하여 샘플에서의 DNA 농도를 측정RNA로부터 DNA를 구별 큐 비트, 같은 형광 계 벤치 탑. gDNA를 최종 농도가 ~ 1-2 NG / μL 있는지 확인하십시오. 혼합 물과 소용돌이를 사용하여 게놈 DNA의 1:10 희석을 준비합니다. 나누어 나노 탄성 액체 분배기 (단계 3)과 호환 소스 플레이트의 적당한 웰에 희석 된 gDNA 30 μL. Labcyte 에코 (550)를 사용하는 경우, 384 웰 폴리 프로필렌 플레이트 (384PP 판)를 사용합니다. 주 :이 경우 적절하게 밀봉 플레이트 -20 ° C에서 1 개월 이상 동안 저장 될 수있다. 2. 1536 멀티 웰 플레이트로 준비하고 분배 qPCR에 마스터 믹스 혼합하는 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브와 소용돌이에 등의 LightCycler 1536 DNA 그린 마스터로 qPCR에 마스터 믹스 850 μL를 준비합니다. 모든 거품을 제거하기 위해 실온에서 20,800 XG에 2 분의 qPCR에 마스터 믹스를 원심 분리기. 단일 1536 멀티 웰 플레이트에 필요한 qPCR의 마스터 믹스의 구성 요소는 다음과 같다S : 효소 마스터 믹스 (집중 녹색 마스터 튜브 1, 5 배), SYBR의 42.5 μL (20 배 농축 된 녹색 마스터 관 (4))의 170 μL, 물 637.5 μl를 결합합니다. 분배도 같은 예술 로빈스 코브라와 같은 벌크 액체 디스펜서를 사용하여 1,536 멀티 웰 플레이트에 / 500 NL. (2.2.1-2.2.4는 코브라에 특이 적으로 참조 단계를 참고.) 다음 설정을 분배 프로그램 만들기 : 액체 클래스, 물; 대기음 볼륨, 800 μL; 볼륨, 500 NL을 분배; 시간, 20 초를 씻는다. 분배 설정에서, 분배 속도가 49.6 mm / 초로 설정되어 있는지 확인하십시오, 오프셋 분배는 0.25 mm로하고, 초과 흡입 된 액체는 잘 돌아 소스에 분배됩니다. 미세 원심 분리 튜브의 뚜껑을 잘라하거나 열어두고 갑판의 위치 1에있는 미세 원심 분리 튜브 홀더, 잘 A1에서 qPCR에 마스터 믹스를 포함하는의 microfuge 튜브를 놓습니다. Aspirat을 편집하여 A1에 '잘 대기음'을 설정E 설정. 이전에 '실행'을 치는 단계 2.2.2에서 설정 한 프로그램의 첫 번째 선택 해제 흡인 및 분배 단계로 qPCR에 마스터 믹스를 분배하고에 세척 단계를 수행합니다. 완료되면, 흡인를 다시 선택하고 qPCR에 마스터 믹스를 분배하기 위해 전체 프로그램을 실행하기 전에 단계를 분배. 코브라는 주요 시스템에 제공 미만 10 분 초기 세척 단계, 유휴 앉아 한 경우, 불필요하다. 물론 각 qPCR에 마스터 믹스를 분배하는 '실행'을 누르십시오. 잘 1536 멀티 웰 플레이트 (저속 PCR 플레이트 스피너를 사용하여 30 초)의 짧은 원심 분리하여 각각의 하단에있는 qPCR에 마스터 믹스를 수집합니다. 3. 분배 템플릿 DNA와 1,536 멀티 웰 플레이트에 프라이머 이러한 에코 (550)과 같은 탄성의 액체 전달 시스템을 사용하여, 1536 멀티 웰 플레이트의 웰에 원하는 희석 gDNA를 5 NL (단계 1.3)을 분배. ECH의 경우550 O를, 플레이트 재 포맷 소프트웨어를 사용하거나 다른 방법으로 전송 프로그램에 사용자 정의 Excel 스프레드 시트를 제공한다. 프로그램은 사용자가 물리적으로 gDNA를 (단계 1.3)을 분배 한 잘되는 소스 일치의 gDNA를 잘 선택한 소스를 확인합니다. 384PP 판에서 액체 계면 활성제없이 버퍼 나타냅니다 소스 플레이트 타입 '384PP_AQ_BP2'를 선택합니다. 프라이머, 순방향 전 혼합 및 에코 (550)과 같은 탄성의 액체 전달 시스템을 사용하여, 1536 멀티 웰 플레이트의 웰에 원하는 각각 50 μM의 최종 농도로 리버스 10 NL 디스펜스. 액체 전달 시스템의 경우, 플레이트 재 포맷 소프트웨어를 사용하여 또는 대안 적 전달을 프로그래밍하는 사용자 Excel 스프레드 시트를 제공한다. 주 : 여기 쉽게하므로 1536 멀티 웰 플레이트 레이아웃 시각적 실시간 PCR 결과를 검사하는 프라이머 염색체 순서와 일치되도록 프라이머를 분배 할 수있다이후 (단계 6). 음향 액체 디스펜서와 호환되는 판에 프라이머를 프리믹스. 에코 (550)의 경우, Labcyte 384LDV (낮은 죽은 볼륨) 판을 사용하고 소스 플레이트 타입 '384LDV_AQ_B'액체가없는 단백질과 간단한 버퍼이다 나타 내기 위해 에코 프로그래밍을 선택합니다. 4. 인감 및 원심 분리기 1536 멀티 웰 플레이트 이러한 열 Plateloc 마이크로 플레이트 실러로 마이크로 시일 시스템을 이용하여, 즉시 열 시일기구와 호환되는 광학적으로 투명한 밀봉을 사용하여 1536 멀티 웰 플레이트를 밀봉. 얼룩 자국을 방지하기 위해 실의 표면을 만지지 마십시오. Plateloc 열 마이크로 실러를 사용하는 경우, 다음 설정을 사용 : 시간 2.0 초, 인감 온도 162 ° C, 공기 압력 PSI (82)를 밀봉. 이 악기는 뜨거워 ~ 5 분 소요 등 사전에 설정되어야한다. Plateloc 열 마이크로의 마감재를 사용하는 경우, adapteR은 좋은 밀봉을 보장하기 위해 악기의 무대에서 1536 멀티 웰 플레이트의 높이를 높이기 위해 사용되어야합니다. 참고 :이 Plateloc 열 마이크로 실러의 스테이지 판을 구입하는 것이 바람직하지만, 다른 솔루션은 1,536 멀티 웰 플레이트의 높이를 높이기 위해 모서리에 하드웨어 상점에서 사용할 수 네 ~ 2mm 두께의 표준 와셔를 삽입하는 것입니다. 즉시 각 웰의 바닥에 모든 시약을 수집하고 실온에서 3 분 동안 2,000 XG에 밀봉 1536 멀티 웰 플레이트를 원심 분리. 5. 리얼 타임 PCR 프로그램 용융 곡선 분석 다음 두 단계 증폭 프로토콜 등의 LightCycler 1536로서 1536 qPCR의 악기. 다음의 LightCycler 1536 소프트웨어 프로그램을 설정 사용 : 사전 배양 : 95 ° C, 1 분 유지, 램프 속도 4.8 ℃ / 초, 아니 취득. 두 단계의 증폭 : 95 ° C의 30주기, 아니 유지,속도 4.8 ℃ / 초 램프, 아니 획득; 64 ° C, 30 초 유지, 램프 속도 2.5 ℃ / 초, 단일 획득]. 용융 곡선 : 95 ° C, 10 초, 램프 속도 4.8 ℃ / 초, 아니 획득; 60 ℃, 1 분, 램프 속도 2.5 ℃ / 초, 아니 획득; 97 ° C, 램프 속도 0.1 ℃ / 초, 5 인수 / (연속) ° C. 쿨 : 40 ° C, 30 초, 램프 속도 2.5 ℃ / 초, 아니 취득. 실행 정의 탭에서 '녹색 인터 염료'에 감지 형식을 설정합니다. 실행 정의 탭에서 '마스터 컨트롤'에 피펫 제어를 설정합니다. 이 기능은 내부 통제의 역할과 추정 위음성을 식별하는 데 유용 1,536 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 qPCR에 마스터 믹스의 존재를 감지합니다. 1,536 qPCR에 악기로 2 ~ 4 단계에서 제조 된 1536 멀티 웰 플레이트를 삽입하고 프로그램을 실행합니다. 6. 데이터 분석 반환 한qPCR의 소프트웨어 내에서 데이터의 육안 검사를 ORM. 참고 : 1,536 소프트웨어는 모두 증폭의 시각화를 가능하게하고 호출 (긍정적, 부정적, 무효, N은 /도 2) 보여주는 열지도뿐만 아니라, 곡선 용융 (긍정적 또는 회색의 색상 규모를 슬라이딩, 교차점 값을 부정적인 위해도 3), 또는 엔드 포인트 형광 (EPF) 값 () 컬러 스케일을 슬라이딩. 원시 데이터 또는 악기에서 오프라인으로 처리하기위한 계산 된 데이터 중 하나에 1,536 형태로 소프트웨어 .txt 파일 (결과 테이블) 또는 .xml 파일에서 데이터 내보내기. 참고 : 높은 신뢰와 양 / 음 및 CP 값 호출을 결정하면서 1536 소프트웨어에 내장 된 고유의 자동화 교차 포인트 (CP)를 호출 알고리즘은 상대적으로 낮은으로 낮은 서브 마이크로 리터 반응 볼륨에서 계정에 모양과 증폭 곡선의 기울기를합니다 형광 값. 의 LightCycler DNA 그린 마스터 사용 인 경우qPCR에 대한 D는 모든 우물 '마스터 컨트롤'을 통과하는지 확인합니다. 실패는 잘은 qPCR에 마스터 믹스 및 누락 된 데이터 포인트가 잠재적 위음성 고려되어야한다을받지 않은 나타냅니다. 모든 우물 '마스터 컨트롤'을 통과하는지 확인합니다. 실패는 잘은 DNA의 mastermix를 수신하고 누락 된 데이터 포인트를 잠재적 위음성을 고려하지 않았다 나타냅니다.

Representative Results

우리는 네 가지 균주에서 추출한 효모 게놈 DNA (gDNA를)과 합성 및 야생형 염색체 3 PCRTag 프라이머 쌍 (1)를 테스트했다. 3 번 염색체는 염색체의 길이에 걸쳐 186 PCRTag 프라이머 쌍 (synIII이다 ~ 2백70킬로바이트 및 야생형 염색체가 3 ~ 3백15킬로바이트)을 갖는다. 프라이머의 두 세트와 네 개의 균주의 각을 테스트하기 위해, 우리는 하단에 각 사분면의 상단 절반 야생형에 합성 PCRTag 프라이머를 할당, 네 사분면, gDNA를 각 유형의 하나에 멀티 웰 플레이트를 나누었다. 게놈 DNA는, 야생형 염색체 3 (야생형, synIXR 2) 인코딩 중 두 효모 균주에서 추출 된 나머지 두 인코딩 합성 염색체 3 (synIII 1 synIII synIXR)한다. qPCR의 마스터 믹스에서 동일하게 배열 된 에코 550 프라이머를 사용하여 gDNA를 PCRTag 프라이머와 다음 벌크 액체 분배기를 사용하여 1536 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 분주쉽게 시각적 비교를 위해 멀티 웰 플레이트의 각 사분면. 멀티 웰 플레이트는 광학적으로 투명 씰로 밀봉 실시간 PCR 분석을 실시 열을했다. 예상대로 qPCRTag이 실험에서는 합성 프라이머 단독 합성 DNA 반대로 증폭함으로써, 대부분의 경우, 증폭, 관찰 (도 2 및도 3). 그러나, 우리는 또한 데이터 세트에서 위음성 및 위양성을 제안, 예상 패턴에서 여러 편차를 관찰했다. 이 실험에서, 마스터 제어가 성공적 웰 플레이트에 각에 mastermix을 벌크 액체 분배 디스펜서를 나타내는, 웰의 100 %에서 검출되었다 (데이타 미기재). 이것은 음성 (false negative)의 하나의 잠재적 인 원인을 배제. 또한, 일부 염색체 3 PCRTags은 적어도 2 SYN 1 WT 포함한 (도 S6에 도시 Annaluru 등의 S7. 1)이 실패하는 것으로 알려진프라이머 쌍; 따라서이 우물은 각 사분면에서 무시 될 수있다. 진정한 위음성이 올바른 에코 (550)의 교정뿐만 아니라 gDNA를 준비하고 설명 된 바와 같이 프라이머 주어진, 우리의 경험하지만, 템플릿 gDNA를 또는 프라이머의 전송의 부족으로 발생할 수있는이 오류의 주요 원인이되지 않았습니다. 전반적으로이 실험에서 위음성 율은 (WT) 템플릿 (~ 2 %) SYN DNA (~ 8 %)로 SYN 프라이머에 대한 다소 높은 있지만과 (WT) 프라이머 매우 낮았다. 위양성는 SYN 프라이머는 gDNA를 WT (및 그 반대)와 혼합 웰 신호의 검출은, 크로스 또는 증폭 프라이머 다이머에서 발생할 수있다. 실제로, 프라이머 이량 체는 겔 전기 영동 (그림 1B)에 의해 종종 볼 수 있습니다 및 오류의 합리적인 소스를 나타냅니다. qPCR에의 적용, 용융 곡선의 시험은 프라이머 이량 체와 같은 다른 종, 신호에 기여 될 수 있는지를 결정하는데 유용 할 수있다. 또한, 반환 한프라이머 이량 성향 프라이머를 식별 할 수있다 주형 DNA의 부재에 분배되어있다 대조 실험을 orming. 너무 많은 PCR 사이클이 수행되는 경우, 또는 열처리 온도가 너무 낮 으면 크로스 증폭 특히, 겔 전기 영동에 의해 관찰 될 수있다. 우리 qPCRTag 프로토콜에 대한 이들 파라미터의 양을 최적화함으로써 증폭에 의한 크로스 위양성의 수를 최소화하기 위해 시도했다. 마지막으로, 실시간 기반의 탐지에 적합하지 않은 프라이머를 식별하는 데 도움이 아니라 각각의 교차점 (CP) 값을 검사 (예를 들어, 그림 3, Bb22, Fb22, Bb46, Fb46). 전반적으로이 실험에서 위양성률은 SYN 템플릿 (~ 10 %)와 WT 프라이머에 대한 (WT) 템플릿 (~ 5 %) 이상으로 SYN 프라이머에 대한 낮았다. 그림 2 : 존재 / AB를 표시 플레이트 열지도qPCRTag 실험에 대한 sence 호출. SYN을 분리하는 흰색 점선 게놈 DNA (사분면 고체 흰색 선으로 구분) 합성 (SYN)를 사용하여 PCRTag 분석을 실시 하였다 및 야생형 (WT) 염색체 3 PCRTag 프라이머 (의 4 개의 다른 종류의 (위 각 사분면) 및 WT (아래)). (WT)과 synIXR gDNA를이. synIII과 synIII synIXR gDNA를가 SYN PCRTag 프라이머로 증폭를 산출, 합성 염색체 3 인코딩 (WT) PCRTag 프라이머로 증폭를 산출, 야생형 염색체 3 인코딩. 프라이머는 왼쪽에서 오른쪽으로 염색체 위치에 따라 배열과 비교를위한 네 개의 사분면에서 동일하게 위치한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3 : 플레이트 열qPCRTag 실험에 대해 교차점 (CP)의 값을 표시하는 맵. 이것은도 2에서와 동일한 데이터 집합이고 플레이트 레이아웃 따라서 동일하다. N / A는 더 증폭 '을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 훨씬 더 높은 처리량을 가능으로 PCRTag의 유전자형 분석으로 실시간 PCR 검출의 설립은 Sc2.0 프로젝트의 중요한 발전이다. 이전 워크 플로는 384 웰 PCR 플레이트, 1.5 시간 열 사이클링 실행 시간, 아가 로스 겔 전기 영동, 겔의 수동 주석 2.5 μL 반응을 지정했습니다.

qPCRTag 분석이라고 여기에 제시된 워크 플로우는 여러 주요 병목 현상을 극복한다. 첫째, qPCRTag 실행은 약 한 시간에, 마무리 (판 설정 플러스 실행 시간)에 시작, 처리 할 수있는 하나의 실험에 4 × 384 웰 플레이트를 응축. 그것은 qPCRTag 분석을위한 잘 당 시약 비용이 낮은 처리량 아가 로스 젤 기반의 접근 방식과 파에 있는지주의하는 것이 중요하다. 그러나, 겔 전기 및 수동 주석을 우회하여, qPCRTag 워크 플로우의 주요 장점 시간과 노동에 상당한 비용 절감을 제공한다. 중요한 qPCRTag 워크 플로우는 EN입니다자동화 tirely 호환.

PCRTag 분석의 출력으로 실시간 탐지의 사용과 주요 관심사는 오탐 (false positive)과 음성 (false negative)의 속도입니다. PCRTag 프라이머 원래 실시간 PCR에 사용하기 위해 설계되지 않은 이후, 그것은 모든 프라이머 쌍이 출력 사용에 적합 할 것으로 예상된다. 이를 위해이 앞까지 실시간 기반 분석에서 작동하지 않는 일부를 제외 모든 PCRTag 프라이머 쌍의 기능과 특이성을 확인하는 것이 중요하다. 예를 들어, 3 번 염색체 PCRTag 위양성 및 네거티브은 바이 PCR 및 대형 데이터 (도 2 및 3) 실시간으로 재현성이 더욱 분석에서 제외 될 수있다. 또한, 실패 알려진 프라이머 쌍은 (겔 전기 영동으로 평가하고,도 S6과 외. ¹ Annaluru의 S7에 도시)도 배제 할 수있다. 이것은 쉽게 EXCLU 단순히 달성딩은 음향 전송 프로토콜을 결함이있는 프라이머 쌍 설정할 때.

가장 높은 처리량 분석과 마찬가지로, 우리는 하류 검증을받을만한 형질 전환 체를 식별하기 위해 기본 화면으로 실시간 PCRTag 감지 기능을 사용하려는. 그 후, 차 심사를위한 황금 표준은 판독과 같은 겔 전기와 PCRTag 분석 유지됩니다. 높은 처리량 실시간 PCR 기술과 최첨단 나노 액체 처리 시스템을 결합 Sc2.0에 대한 PCRTag 분석의 응용 프로그램을 넘어 신속하고 자동화 된 분석을 가능하게하고 많은 분야에 영향을 미칠 수있는 가능성이있다. 예를 들어,이 흐름은 높은 처리량 라이브러리 스크리닝, 감염성 질병 진단, 마이크로 바이 분석, 최첨단 게놈 편집에 적용 할 수는 동시에 다수의 궤적을 수정하려고 접근한다.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은에 의해 부분적으로 지원되었다 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 MCB-0718846과 (JDB에) 방위 고등 연구 계획국 계약 N66001-12-C-4020. LAM은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회에서 박사 친교에 의해 투자되었다. 이 문서의 공개는 로슈가 후원한다.

Materials

			Yeast gDNA prep
yeast gDNA	custom	custom	template for real time PCR
Acid-washed glass beads (0.5mm)	Sigma	G8772	yeast cell lysis
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)	Invitrogen	15593-031	yeast cell lysis
5432 Mixer	Eppendorf	5432	yeast cell lysis
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807	yeast cell lysis
Qubit 3.0 Fluorometer	Life Technologies	Q33216	gDNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Life Technologies	Q32850	gDNA quantification
Labcyte 384PP plate	Labcyte	P-05525	gDNA source plate

			DNA Green Mastermix prep and dispensing
LightCycler 1536 DNA Green	Roche	5573092001	real time PCR mastermix
1.5mL Microfuge Tube Holder	ARI	EST BD060314-1	microfuge tube holder for deck of Cobra
LightCycler 1536 Multiwell Plate	Roche	5358639001
Cobra liquid handling system	Art Robbins Instruments	630-1000-10	dispense qPCR master mix into 1536 plate
PCR Plate Spinner	VWR	89184-608	cenrifugation of 1536 plate

			Template and primer dispensing
PCRTag primers	IDT	custom	premixed forward and reverse, [50uM] each
TempPlate pierceable sealing foil, sterile	USA Scientific	2923-0110	temporary seal for PCRTag primer plates
Labcyte LDV 384 well plate	Labcyte	LP-0200	pre-mixed primer source plate
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte		transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate
Plateloc Thermal Microplate Sealer	Agilent	G5402-90001	heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run
Clear Permanent Seal	Agilent	24212-001	optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage	Agilent	G5402-20008	can substitute ~2mm thick washers
Sorvall Legend XTR	Thermo Scientfic	75-004-521	centrifuge heat sealed 1536 plate
Industrial Air Compressor	Jun Air	1795011	to run the Echo and Heat Sealer

			Real Time PCR
LightCycler 1536	Roche		requires 220V outlet

Referencias

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Dymond, J. S., et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).
Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-547 (1996).
Dymond, J., Boeke, J. The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization. Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).
Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).
Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. Design-A-Gene with GeneDesign. Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).
Lajoie, M. J., et al. Probing the limits of genetic recoding in essential genes. Science. 342 (6156), 361-363 (2013).
Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast. Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).
Dymond, J. S. Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).
Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).

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Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis – A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).