qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Leslie A. Mitchell; Nick A. Phillips; Andrea Lafont; James A. Martin; Rupal Cutting; Jef D. Boeke

doi:10.3791/52941

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biología

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

Published: May 25, 2015

doi:

10.3791/52941

Leslie A. Mitchell¹, Nick A. Phillips¹, Andrea Lafont², James A. Martin¹, Rupal Cutting², Jef D. Boeke¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,Institute for Systems Genetics, ²Roche Life Science, USA

Summary

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Abstract

De Synthetic Gist Genome Project (Sc2.0) streeft naar 16 designer gist chromosomen bouwen en te combineren in een enkele gistcel. Om een synthetische chromosoom, synIII ¹ en een synthetisch chromosoom arm synIXR ² heden, werden geconstrueerd en de in vivo effecten aangetoond in de afwezigheid van de overeenkomstige wildtype chromosomen. Een belangrijk kenmerk van het ontwerp Sc2.0 chromosomen is de introductie van PCRTags, die korte, re-gecodeerde sequenties in open reading frames (ORF) dat differentiatie van synthetische chromosomen mogelijk uit hun wild-type tegenhangers. PCRTag primers hybridiseren selectief ofwel synthetische of wildtype chromosomen en de aanwezigheid / afwezigheid van elk type DNA kan worden getest met een eenvoudige PCR-test. De standaard uitlezing van de PCRTag assay aanwezigheid / afwezigheid van amplicons evalueren met agarosegelelektroforese. Echter, met een gemiddelde PCRTag amplicon dichtheid van één per 1,5 kb en agenome grootte van ~ 12 Mb, zal het ingevulde Sc2.0 genoom coderen ruwweg 8.000 PCRTags. Om throughput verbeteren, hebben we een real time PCR-gebaseerde detectie assay voor PCRTag genotyperen dat we qPCRTag analyse noemen ontwikkeld. De workflow bepaalt 500 nl reacties in een 1536 multiwell plaat, waardoor wij testen maximaal 768 PCRTags met zowel synthetische en wild-type primer paren in één experiment.

Introduction

Sc2.0 of de Synthetic Gist Genome Project ( www.syntheticyeast.org ), is het doel van het ontwerpen en bouwen van een geheel synthetische eukaryotisch genoom ingesteld. Met behulp van de zeer samengesteld genoomsequentie van Saccharomyces cerevisiae ³ als uitgangspunt, elk van de zestien lineaire chromosomen is opnieuw ontworpen om een reeks van design principes die aangeven behoud cel fitness, het verbeteren van stabiliteit van het genoom, en het vergroten van de genetische flexibiliteit te voldoen. Zo worden destabiliserende elementen als herhalingen van Sc2.0 chromosomen verwijderd. Alle gevallen van TAG stopcodons worden opnieuw gecodeerd naar TAA 'vrij' een codon in de laatste soort voor het invoeren van een niet-genetisch gecodeerde aminozuren. Daarnaast is een induceerbaar evolutie systeem, Scramble, mogelijk gemaakt door het Cre-lox systeem, maakt een ongekende capaciteit om afgeleide genomen met nieuwe structuren ⁴ te genereren.

<p class="Jove_content"> ander belangrijk element in de Sc2.0 genoom is de invoering van PCRTags, die als DNA watermerken te volgen van synthetische en wildtype DNA mogelijk. PCRTags zijn kort, re-gecodeerde segmenten in ORF op synthetische chromosomen; terwijl de PCRTag sequenties verschillen op DNA niveau tussen synthetisch en wildtype chromosomen, de gecodeerde eiwitten identiek is in aminozuursequentie en dus vermoedelijk functie. PCRTag sequenties zijn speciaal ontworpen als primer bindingsplaatsen selectieve amplificatie (Figuur 1A) te vergemakkelijken. PCRTag ontwerp wordt uitgevoerd met de meest verschillende "algoritme GeneDesign ^5,6, hetgeen opnieuw gecodeerde synthetische sequenties die typisch ~ 60% verschillen van de natieve sequenties (minimaal 33%) bij een smelttemperatuur tussen 58 ° C en 60 ° C en amplicon lengte tussen 200-500 basenparen ^2. Hercodering niet binnen de eerste 100 bp van elk ORF toegelaten, aangezien deze gebieden is bekendhebben speciale voorkeuren in termen van codongebruik ^7. Samen vormen deze ontwerpregels voorstander hoge prestaties van bijna alle PCRTags onder één set van PCR omstandigheden waarbij synthetische en wild type PCRTag primerparen uitsluitend binden en versterken synthetische en inheemse DNA, respectievelijk (Figuur 1B).

Figuur 1:. PCRTag schema (A) PCRTags worden gehercodeerd sequenties binnen open reading frames (ORF) van genen Sc2.0 chromosomen. (B) Synthetische (SYN) en wild type (WT) PCRTag primers uitsluitend binden en versterken synthetische en wild type genoom DNA (gDNA), respectievelijk. Deze afbeelding toont een analyse van ~ 30 kb segment van de linker arm van chromosoom zes testen dertien PCRTag primerparen behulp WT of semi-synVIL2 gDNA als matrijs. In veel gevallen codeert voor een ORF meerdere PCRTag. De aanwezigheid / afwezigheid van amplicons PCRTag wordt beoordeeld via agarose gel elektroforese. PCRTag amplicons variëren in grootte van 200 bp tot 500 bp. De sneller migrerende species onderaan de panelen primer dimeren.

PCRTag analyse heeft zich bewezen als een belangrijk instrument in de assemblage van Sc2.0 chromosomen zijn. In een typisch experiment 30-50 kb synthetisch DNA, coderend 20-30 PCRTags, wordt getransformeerd in gistcellen tot het overeenkomstige wildtype DNA ^1,2,8 vervangen. PCRTag analyse wordt vervolgens gebruikt om transformanten die synthetische maar niet wildtype PCRTags verspreid dat segment van DNA coderen te identificeren, of zogenaamde "winnaars. Het is meestal niet nodig om meerdere transformanten testen om 'winnaars' te identificeren, zodat doorvoer en de kosten van PCRTag analyse zijn belangrijke overwegingen. Momenteel zijn er twee Sc2.0 chromosomen zijn afgerond (synIII ¹ es synIXR ^2), die minder dan 10% van de Sc2.0 genoom, although meer dan de helft van de resterende chromosomen worden momenteel synthese en assemblage. De omvang van PCRTag analyse nodig is voor dit project wordt snel sneller dan de mogelijkheid om gels draaien en handmatig de score van de aanwezigheid van synthetisch DNA en de afwezigheid van wild type DNA.

Voor een betere doorvoer van het PCRTag assay hebben wij een workflow met real time PCR met gebruik van agarose gelelektroforese omzeilen ontwikkeld. De workflow maakt gebruik van een bulk vloeistof dispenser om qPCR mastermix verdelen in elk putje van een 1536 multiwell plaat, een nanoschaal akoestische vloeistof dispenser om template-DNA en primers te dragen, en een 1536 qPCR thermocycler, waardoor we reacties miniaturiseren tot 500 nl en maximaliseren van de doorvoer. Bovendien analyse kan worden geautomatiseerd. Dit type van high throughput genotypering protocol moet generalizable elk project waarvoor de analyse van de vele klonen op meerdere loci zijn.

Protocol

1. Bereid Gist Genomic DNA (gDNA) Bereid een voorraad van gist Lysis Buffer 9 die 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1% SDS bevat (w / v), 2% Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA pH 8,0. Als uitgangsmateriaal gebruik ~ 2 x 10 6 cellen, die gewoonlijk overeenkomt met ~ 100 pi verzadigde kweek van melkzuurbacteriën van de BY4741 10 achtergrond. Gekweekte cellen worden verzameld door centrifugeren bij 1000 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Zuig de supernatant. Voeg 200 ul van Gist Lysis Buffer en resuspendeer de celpellet door pipetteren. Voeg ~ 300 ul van zuur gewassen glasparels zodanig dat het niveau van korrels ongeveer 1 mm onder het niveau van de celsuspensie. In een zuurkast voeg 200 ul fenol / chloroform / isoamylalcohol (25: 24: 1). Cap de microfugebuis en ervoor zorgen dat er geen kralen vastzitten tussen de kap en de buis als dit zal resulteren in lekken tijdens het schudden(Stap 1.6). Omkeren 3 keer te mengen en controleren of de dop verzegeld. Schud de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met een benchtop menger, zoals een Eppendorf 5432. Centrifugeer bij 20.800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Overdracht 75 pl van de waterige fase naar een nieuwe microcentrifuge buis met 1 ml 100% ethanol. Omkeren 10 keer om te mengen. Pellet de DNA door centrifugatie bij 20.800 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Zuig het supernatans niet losraakt het DNA pellet. Was de pellet met 500 pl 70% ethanol. Centrifugeer bij 20.800 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zuig het supernatant zonder loskomen van het DNA pellet en air-droog de pellet met de microfugebuizen kap open tot overmaat ethanol verdampt is, dat is meestal rond de 10 min. Resuspendeer de DNA pellet in 75 gl 10 mM Tris pH 7,4 en vortex mengen. Bewaar het monster bij -20 ° C oneindig. Meet de concentratie van DNA in het monster met behulp van eenBenchtop fluorimeter zoals qubit, die DNA onderscheidt van RNA. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van gDNA is ~ 1-2 ng / ul. Bereid een 1:10 verdunning van genoom DNA met water en vortex te mengen. Aliquot 30 pi van verdunde gDNA in de juiste putje van een bronplaat die compatibel is met nanoschaal akoestische vloeistofuitreiker (stap 3) is. Bij gebruik van een Labcyte Echo 550, gebruik dan een 384 en polypropyleen plaat (384PP plaat). OPMERKING: Bij geschikte afgedichte deze plaat kan worden bewaard gedurende ten minste één maand bij -20 ° C. 2. Bereid en Dispense qPCR Master Mix in een 1536 Multiwell Plate Bereid 850 ul qPCR master mix zoals LightCycler 1536 DNA Green Master in een 1,5 ml microcentrifugebuis en vortex te mengen. Centrifugeer de qPCR master mix voor 2 min bij 20.800 xg bij kamertemperatuur om eventuele luchtbellen te verwijderen. De componenten van de qPCR master mix vereist voor een multiwell plaat 1536 zijn als volgts: Combineer 170 ul enzym master mix (Green Master Tube 1, 5x geconcentreerde), 42,5 ul van SYBR (Green Master Tube 4, 20x geconcentreerd) en 637,5 pl water. Doseer 500 nl / ver in 1536 een multiwell plaat met behulp van een vloeibare bulk dispenser zoals de Art Robbins Cobra. (Merk op dat de stappen 2.2.1-2.2.4 verwijst specifiek naar de Cobra.) Maak een afgifte-programma met de volgende instellingen: vloeibaar klasse, water; aspireren volume, 800 pl; afzien volume, 500 nl; wassen tijd, 20 sec. In het afzien instellingen, controleert de dispense snelheid wordt ingesteld op 49,6 mm / sec, het afzien offset 0,25 mm, en overtollige aangezogen vloeistof terug in de bron worden afgegeven ook. Plaats de microfugebuis met de qPCR master mix in goed A1 van de microfugebuis houder, die is gelegen in deck positie 1. Snijd de dop van de microfugebuis of gewoon open laten. Stel de 'Zuig goed' tot A1 door het bewerken van de Aspirate instellingen. Voer een wasstap voorafgaand aan doseren qPCR master mix van eerste-de keuze van de aspireren en afzien van stappen van de set-up in stap 2.2.2 programma en vervolgens raken 'run'. Eenmaal voltooid, re-selecteer het aspireren en afzien stappen voorafgaand aan het uitvoeren van het volledige programma af te zien qPCR master mix. Indien de Cobra gezeten inactief minder dan 10 minuten de eerste wasstap, dat dient om het systeem te ontluchten, overbodig. Hit 'run' af te zien van qPCR master mix aan elk putje. Verzamel de qPCR master mix op de bodem van elk putje door korte centrifugeren van de 1536 multiwell plaat (30 sec met een lage snelheid PCR plaat spinner). 3. Doseer Template DNA en primers in de 1536 Multiwell Plate Breng 5 nl van verdunde gDNA (stap 1,3) in de gewenste putjes van de multi- putjesplaat 1536 middels een akoestisch vloeistof transfersysteem, zoals Echo 550. Voor de Echo 550, gebruik maken van de plaat Reformat software of als alternatief te bieden een aangepaste Excel spreadsheet om de overdracht te programmeren. Zorg ervoor dat de geselecteerde bron goed voor de gDNA in het programma past bij de bron goed waarin u fysiek afgezien van de gDNA (stap 1.3). Kies de bronplaat type '384PP_AQ_BP2 ", die aangeeft de vloeistof in de 384PP plaat een buffer zonder surfactanten. Breng 10 nl van primers, voorgemengd vooruit en achteruit tot een eindconcentratie van 50 uM elk, in de gewenste putjes van de multi- putjesplaat 1536 middels een akoestisch vloeistof transfersysteem, zoals Echo 550. Voor de vloeibare transfersysteem, gebruik maken van de plaat Reformat software of als alternatief te bieden een aangepaste Excel spreadsheet om de overdracht te programmeren. OPMERKING: Hier is het mogelijk om primers te doseren zodat de lay-out op de 1536 multi- putjesplaat past het chromosomale volgorde van de primers zodat het gemakkelijk is om de real time PCR resultaten visueellater (stap 6). Premix de primers in een plaat die compatibel is met de akoestische vloeistof dispenser is. Voor de Echo 550, gebruik dan een Labcyte 384LDV (laag dood volume) plaat en kies de bron plaat type '384LDV_AQ_B' bij het programmeren van de Echo aan te geven van de vloeistof is een eenvoudige buffer zonder eiwitten. 4. Seal en Centrifuge de 1536 Multiwell Plate Met behulp van een microplaat sealer systeem zoals de Plateloc Thermal Microplate Sealer, onmiddellijk sluit de 1536 multiwell plaat met behulp van optisch heldere afdichting die compatibel zijn met de hitte sealer instrument is. Raak het oppervlak niet aanraken van de afdichting om smudge vlekken te voorkomen. Als het gebruik van de Plateloc Thermal Microplate Sealer, gebruikt u de volgende instellingen: verzegelen tijd 2,0 sec, seal temperatuur 162 ° C, de luchtdruk 82 psi. Dit instrument is nu ~ 5 min verhitten en bijgevolg ten worden ingeschakeld voren. Als het gebruik van de Plateloc Thermal Microplate Sealer, een adapter worden gebruikt om de hoogte van de 1536 multi- putjesplaat van de fase van het instrument te verhogen om een goede afdichting te waarborgen. OPMERKING: Hoewel het de voorkeur om een Stage Plate kopen voor de Plateloc Thermal Microplate Sealer, een alternatieve oplossing is tot vier ~ 2 mm dik standaard wasmachines beschikbaar te voegen op elke bouwmarkt in de hoeken om de hoogte van de 1536 multiwell plaat te verhogen. Centrifugeer Onmiddellijk de afgedichte 1536 multiwell plaat bij 2000 xg gedurende 3 min bij kamertemperatuur om alle reagentia te verzamelen op de bodem van elk putje. 5. Real Time PCR Programmeer 1536 qPCR instrument, zoals de LightCycler 1536, met een tweestaps amplificatie protocol gevolgd door een smelt curve analyse. Met behulp van de software LightCycler 1536 het opzetten van een programma als volgt: Pre-incubatie: 95 ° C, 1 min hold, toenamesnelheid 4,8 ° C / sec, geen verwerving. Two Step Amplificatie: 30 cycli van [95 ° C, geen vat,ramp rate 4.8 ° C / sec, geen verwerving; 64 ° C, 30 sec hold, oprit snelheid 2,5 ° C / sec, enkele overname]. Smelt curve: 95 ° C, 10 sec, ramp rate 4.8 ° C / sec, geen verwerving; 60 ° C, 1 min, helling snelheid 2,5 ° C / sec, geen verwerving; 97 ° C, oprit snelheid van 0,1 ° C / sec, 5 acquisities / ° C (continu). Cool: 40 ° C, 30 sec, oprit snelheid 2,5 ° C / sec, geen verwerving. Stel de Detection Format om 'Green intercalerende Dye' in het tabblad Run Definition. Stel het pipetteren controle om 'Master Control' op het tabblad Run Definition. Deze functie dient als een interne controle en de aanwezigheid van qPCR Master Mix van elke well van de multi-putjesplaat 1536, hetgeen nuttig vermeende valse negatieven identificeren detecteert. Plaats de 1536 multiwell plaat bereid in stappen 2-4 in de 1536 qPCR instrument en start het programma. 6. Data Analysis PerfORM visuele inspectie van de gegevens binnen de qPCR software. Opmerking: De 1536 software maakt visualisatie van zowel de amplificatie en smelt curven, en een warmte kaart van de oproep (positieve, negatieve, ongeldige, N / A, figuur 2), de doorlaatpost waarde (glijdende kleurenschaal positieve of grijs voor negatieve Figuur 3), of een eindpunt fluorescentie (EPF) waarde (glijdende schaal kleur). Gegevens van de 1536 Software in de vorm van een txt-bestand (resultaten tabel) of een XML-bestand met ofwel de ruwe data of berekende gegevens voor het verwerken van offline uit het instrument Export. OPMERKING: De gepatenteerde geautomatiseerde kruispunt (Cp) roepen algoritme is ingebouwd in de 1536 software houdt rekening met de vorm en de helling van de amplificatiecurve het bepalen van positieve / negatieve en Cp waarde oproepen met grote zekerheid bij lage sub microliter reactievolume met relatief lage fluorescentiewaarden. Als de LightCycler DNA Green Master was gebruikd voor qPCR, controleren of alle putten geslaagd voor de 'master control'. Een onvoldoende geeft het ook niet ontvangen qPCR master mix en de ontbrekende gegevens punt moet worden beschouwd als een mogelijk vals negatief. Controleer of alle putjes geslaagd voor de 'master control'. Een onvoldoende geeft het goed deed DNA mastermix niet ontvangen en overwegen de ontbrekende gegevens punt een potentiële vals negatief.

Representative Results

We testten synthetische en wild type chromosoom 3 PCRTag primerparen 1 met gist genomische DNA (gDNA) gewonnen uit vier verschillende stammen. Chromosoom 3 heeft 186 PCRTag primerparen dat de lengte van het chromosoom overspannen (synIII is ~ 270 kb en wildtype chromosoom 3 is ~ 315 kb). Aan elk van de vier stammen met beide primers testen, verdeelden we de multi-putjesplaat in vier kwadranten, een voor elk van gDNA, toewijzen PCRTag synthetische primers om de bovenste helft van elk kwadrant en wildtype naar de onderste helft. Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit de giststammen, waarvan twee coderen voor wildtype chromosoom 3 (wild type, synIXR 2), terwijl de overige twee encode synthetische chromosoom 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR Master Mix werd verdeeld in elk putje van een 1536 multiwell plaat met behulp van een vloeibare bulk dispenser, gevolgd door gDNA en PCRTag primers met behulp van de Echo 550. De primers waren identiek gekleed inelk kwadrant van de multiwell plaat voor gemakkelijke visuele vergelijking. De multiwell plaat werd daarna warmte afgedicht met optisch heldere afdichting en onderworpen aan real time PCR-analyse. In dit experiment waargenomen qPCRTag we, grotendeels, amplificatie zoals verwacht, waarbij synthetische primers uitsluitend geamplificeerd synthetisch DNA en vice versa (figuren 2 en 3). Echter, zagen we ook verschillende afwijkingen van het verwachte suggereert valse negatieve en valse positieven in de dataset. In dit experiment werd de master control gedetecteerd in 100% van putjes, waarin de bulk vloeistofuitreiker met succes afgegeven mastermix in elke put op de plaat (data niet getoond). Dit sluit een potentiële bron van valse negatieven. Bovendien zijn sommige chromosoom 3 PCRTags bekend te falen (getoond in figuren S6 en S7 van Annaluru et al. 1), met ten minste 2 SYN en 1 WTprimer paren; waardoor deze putten kunnen worden genegeerd in elk kwadrant. True valse negatieven kunnen voortvloeien uit een gebrek aan overdracht van template gDNA of primers, maar in onze ervaring, gezien de juiste ijking van de Echo 550 alsmede de voorbereiding van gDNA en primers zoals beschreven, is dit een belangrijke bron van fouten niet geweest. Overall in dit experiment valse negatieve prijs was zeer laag voor primers met WT WT matrijs (~ 2%), hoewel iets hoger SYN primers met SYN DNA (~ 8%). Valse positieven, de detectie van signaal in putjes waarin SYN primers worden gemengd met WT gDNA (en vice versa), gevolg kunnen zijn van amplificatie of primer dimeren. Inderdaad, primer dimeren zijn vaak zichtbaar door gelelektroforese (Figuur 1B) en naar redelijkheid bron van fouten. Voor de toepassing van qPCR kan het onderzoek van smelt curven nuttig zijn om te bepalen of verschillende soorten, zoals primer dimeren, kunnen bijdragen aan het signaal. Verder, performing een controle-experiment waarbij primers worden afgeleverd in afwezigheid van matrijs-DNA zou kunnen primers identificeren met een neiging tot dimeriseren. Cross amplificatie kunnen worden gevolgd door gelelektroforese, met name indien teveel PCR-cycli worden uitgevoerd of wanneer de annealing temperatuur te laag. We hebben geprobeerd om het aantal valse positieven te minimaliseren door cross amplificatie door het optimaliseren van beide parameters voor qPCRTag protocol. Tenslotte onderzoekt het kruispunt (Cp) waarden voor elk putje kan helpen bij het identificeren primers die niet geschikt zijn voor real time-gebaseerde detectie (figuur 3, bijvoorbeeld, BB22, Fb22, Bb46, Fb46). Overall in dit experiment valse positieven laag was voor SYN primers met WT template (~ 5%) en hoger voor WT primers met SYN template (~ 10%). Figuur 2: Plaat warmte kaart weergeven van de aanwezigheid / absence oproep voor een qPCRTag experiment. Vier verschillende types van genoom DNA (kwadranten gescheiden door stevige witte lijnen) werden onderworpen aan PCRTag analyse met behulp van synthetische (SYN) en wild type (WT) chromosoom 3 PCRTag primers (onderbroken witte lijnen om SYN scheiden (top ) en WT (onder) in elk kwadrant). WT en synIXR gDNA coderen wild type chromosoom 3, waardoor amplificatie met WT PCRTag primers. SynIII en synIII synIXR gDNA coderen synthetische chromosoom 3, waardoor amplificatie met SYN PCRTag primers. Primers worden opgesteld op basis van hun links naar rechts chromosomale positionering en gepositioneerd identiek in de vier kwadranten voor de vergelijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Plaat warmteKaart tonen kruispunt (Cp) waarde voor een qPCRTag experiment. Dit is dezelfde dataset als in figuur 2 en de plaat indeling is daarmee identiek. N / A verwijst naar 'nee versterking'. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Integratie van real-time PCR-detectie in de PCRTag genotypering test is een belangrijke ontwikkeling voor de Sc2.0 project als het in staat stelt aanzienlijk hogere doorvoer. De vorige workflow aangegeven 2,5 ul reacties in 384 goed PCR-platen, 1,5 uur thermische fietsen run time, agarosegelelektroforese en handmatige annotatie van de gel.

De hier gepresenteerde workflow, genaamd qPCRTag analyse, overwint een aantal belangrijke knelpunten. Eerst een qPCRTag run condenseert 4 x 384 putjes in één experiment dat kan worden verwerkt, start tot finish (plaat opzetten plus looptijd), in ongeveer een uur. Het is belangrijk om op te merken dat de kosten reagens per goed voor qPCRTag analyse is op een lijn met de lagere doorvoersnelheid agarose-gel gebaseerde aanpak. Echter, door het omzeilen van gelelektroforese en handmatige annotatie, de qPCRTag workflow biedt aanzienlijke besparingen in tijd en arbeid, die de belangrijkste voordelen zijn. Belangrijk is dat de qPCRTag workflow is entirely compatibel met automatisering.

Een groot probleem bij het gebruik van real time detectie als de output van de PCRTag test is het aantal valse positieven en valse negatieven. Aangezien PCRTag primers werden oorspronkelijk ontworpen voor gebruik in real time PCR, wordt verwacht dat niet alle primerparen geschikt voor dit uitgevoerd wordt. Daarom is het belangrijk om de functie en specificiteit van PCRTag primerparen valideert om deelverzameling die niet werken in de real-time-based assay voorin sluiten. Zo chromosoom 3 PCRTag valse positieven en negatieven bijproducten en grote reproduceerbaar in de real time PCR-gegevens (figuren 2 es 3) en deze kunnen van verdere analyse worden uitgesloten. Verder primerparen bekend mislukt (beoordeeld door gelelectroforese en getoond in Figuren S6 es S7 van Annaluru et al. ¹⁾ kan ook worden uitgesloten. Dit is eenvoudig te eenvoudig volbracht excluDing de defecte primerparen bij het opzetten van de akoestische transfer protocol.

Net als de meeste high throughput testen, zijn we van plan om real time PCRTag detectie gebruiken als primaire scherm om transformanten die verder stroomafwaarts validatie verdienen identificeren. Vervolgens zal de gouden standaard voor de secundaire screening PCRTag analyse met gelelektroforese als de uitlezing blijven. Afgezien van de toepassing van PCRTag analyse voor Sc2.0, state-of-the-art nanoschaal liquid handling systemen te combineren met een high throughput real-time PCR-technologie maakt een snelle en geautomatiseerde analyse en heeft potentie om vele gebieden beïnvloeden. Bijvoorbeeld kan deze workflow worden toegepast high throughput screening bibliotheek, infectieziekten diagnose, microbiome analyse en cutting-edge genoom editing benaderingen probeert meerdere loci gelijktijdig wijzigen.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation Grant MCB-0718846 en de Defense Advanced Research Projects Agency Contract N66001-12-C-4020 (tot JDB). LAM werd gefinancierd door een postdoctorale beurs van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada. De publicatie van dit artikel wordt gesponsord door Roche.

Materials

			Yeast gDNA prep
yeast gDNA	custom	custom	template for real time PCR
Acid-washed glass beads (0.5mm)	Sigma	G8772	yeast cell lysis
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)	Invitrogen	15593-031	yeast cell lysis
5432 Mixer	Eppendorf	5432	yeast cell lysis
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807	yeast cell lysis
Qubit 3.0 Fluorometer	Life Technologies	Q33216	gDNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Life Technologies	Q32850	gDNA quantification
Labcyte 384PP plate	Labcyte	P-05525	gDNA source plate

			DNA Green Mastermix prep and dispensing
LightCycler 1536 DNA Green	Roche	5573092001	real time PCR mastermix
1.5mL Microfuge Tube Holder	ARI	EST BD060314-1	microfuge tube holder for deck of Cobra
LightCycler 1536 Multiwell Plate	Roche	5358639001
Cobra liquid handling system	Art Robbins Instruments	630-1000-10	dispense qPCR master mix into 1536 plate
PCR Plate Spinner	VWR	89184-608	cenrifugation of 1536 plate

			Template and primer dispensing
PCRTag primers	IDT	custom	premixed forward and reverse, [50uM] each
TempPlate pierceable sealing foil, sterile	USA Scientific	2923-0110	temporary seal for PCRTag primer plates
Labcyte LDV 384 well plate	Labcyte	LP-0200	pre-mixed primer source plate
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte		transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate
Plateloc Thermal Microplate Sealer	Agilent	G5402-90001	heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run
Clear Permanent Seal	Agilent	24212-001	optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage	Agilent	G5402-20008	can substitute ~2mm thick washers
Sorvall Legend XTR	Thermo Scientfic	75-004-521	centrifuge heat sealed 1536 plate
Industrial Air Compressor	Jun Air	1795011	to run the Echo and Heat Sealer

			Real Time PCR
LightCycler 1536	Roche		requires 220V outlet

Referencias

Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344 (6179), 55-58 (2014).
Dymond, J. S., et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).
Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-547 (1996).
Dymond, J., Boeke, J. The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization. Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).
Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).
Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. Design-A-Gene with GeneDesign. Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).
Lajoie, M. J., et al. Probing the limits of genetic recoding in essential genes. Science. 342 (6156), 361-363 (2013).
Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast. Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).
Dymond, J. S. Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).
Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artículo

Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis – A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).