Summary

Las inyecciones intramusculares largo de las placas motoras de final: un abordaje mínimamente invasivo de trazadores de traslado directamente en neuronas motoras

Published: July 13, 2015
doi:

Summary

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Abstract

Las enfermedades que afectan la integridad de las neuronas motoras de la médula espinal se encuentran entre las enfermedades neurológicas más debilitantes. Durante las últimas décadas, el desarrollo de varios modelos animales de estos trastornos neuromusculares ha proporcionado la comunidad científica con diferentes escenarios terapéuticos dirigidos a retrasar o revertir la progresión de estas condiciones. Al tomar ventaja de la maquinaria retrógrado de las neuronas, uno de estos enfoques ha sido para apuntar los músculos esqueléticos con el fin de genes terapéuticos de transporte en los correspondientes neuronas motoras de la médula espinal. Aunque una vez prometedor, el éxito del enfoque de prestación de dicho gen se ha visto obstaculizada por el número subóptimo de las neuronas motoras transducidas se ha mostrado hasta ahora a ceder. Placas de extremo del motor (MEPS) son regiones altamente especializados en la musculatura esquelética que están en contacto sináptica directa a la médula espinal α neuronas motoras. A este respecto, es importante señalar que, hasta ahora, los esfuerzos para retrógradamentegenes de transferencia en neuronas motoras se hicieron sin referencia a la ubicación de la región de MEP en los músculos objetivo. A continuación, describimos un protocolo simple 1) para revelar la ubicación exacta de los eurodiputados en la superficie de los músculos esqueléticos y 2) para utilizar esta información para guiar la entrega intramuscular y posterior transporte retrógrado óptima de trazadores retrógradas en neuronas motoras. Esperamos utilizar los resultados de estos experimentos de rastreo en otros estudios en la investigación de transporte retrógrado de genes terapéuticos a las neuronas motoras de la médula espinal a través de la focalización de los eurodiputados.

Introduction

La pérdida de control del movimiento voluntario que resulta de condiciones neurológicas como la enfermedad de la motoneurona espinal-y así como la atrofia muscular de Duchenne es una enfermedad debilitante que tiene impacto duradero de alto y largo en la vida cotidiana de los individuos afectados. Durante la última década, los esfuerzos de investigación con el objetivo de detener o al menos retrasar los efectos nocivos de estas enfermedades neuromusculares ha sido una prioridad para muchos médicos y científicos de todo el mundo. En este sentido, la reciente generación de modelos animales que imitan estas enfermedades neuromusculares ha sido fundamental en la obtención de conocimientos fundamentales de los mecanismos fisiológicos subyacentes al desarrollo y la progresión de estas condiciones 1-13. El tratamiento de estas enfermedades neuromusculares requiere acceso directo a la médula espinal y se puede lograr por medio de inyecciones en la médula espinal 14,15. Los recientes avances en la terapia génica también han atacado a los músculos estriados de la parte superior ymiembros inferiores a los genes terapéuticos de transporte a los correspondientes motoneuronas α que se encuentran dentro del asta ventral de la médula espinal 1,9-13. Sin embargo, esta estrategia una vez prometedora no ha logrado mejorar el resultado de estas condiciones neurológicas. Si bien es justo concluir que estos pobres resultados podrían ser, al menos en parte, ser atribuible a la baja eficacia de estos genes protectores, no se puede excluir la baja eficacia de estos métodos de administración de genes.

Placas terminales del motor (los diputados) son regiones especializadas de las miofibras esqueléticas que se sangría por los terminales de los axones de las grandes fibras motoras periféricas procedentes de α neuronas motoras. En conjunto, las terminaciones de fibras nerviosas periféricas y los eurodiputados forman la unión neuromuscular, es decir, el lugar donde los impulsos sinápticos son provocados por la liberación anterógrada del neurotransmisor, la acetilcolina. Es importante destacar que la relación entre las fibras nerviosas periféricas y los eurodiputados es bi-direccional, aunque diferentes motores son responsables del transporte de moléculas y orgánulos hacia y fuera de la neurona Somata 16-18. A la luz de estas consideraciones anatómicas, los eurodiputados parecen ser el blanco de elección para la entrega y transporte retrógrado subsiguiente de material genético a las neuronas motoras correspondientes. En este contexto, no es sorprendente que el éxito de la transducción de las neuronas del motor depende en gran medida de la distancia entre la inyección intramuscular de vectores virales y eurodiputados del músculo 19-20. Sorprendentemente, sin embargo, la localización exacta de las zonas de MEP en las miofibras de la rata y el ratón de laboratorio, las dos especies de elección para modelar enfermedades neuromusculares, no estaban disponibles hasta hace poco.

Hemos producido mapas completos de la región MEP durante varios músculos de las extremidades anteriores en la rata y el ratón 21-22. Más recientemente, hemos mostrado los detalles de la organización del MEP region durante varios músculos de la extremidad posterior del ratón 23 y que están analizando las características de los diputados al Parlamento Europeo en la extremidad posterior de la rata. En nuestras manos, inyecciones intramusculares de trazadores retrógradas dirigidas a la totalidad de las zonas de MEP en estos músculos dieron lugar a las neuronas motoras más marcadas que se abarcan segmentos más de la médula espinal que se informó anteriormente. Aquí presentamos el protocolo que se ha desarrollado en los últimos años para revelar la ubicación de los diputados en la superficie externa, así como en toda la profundidad de las extremidades posteriores y músculos de la extremidad anterior, tanto en el ratón y la rata.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales aquí descritos cumplen con el Comité de Cuidado y Ética Animal de la UNSW Australia y se llevaron a cabo de acuerdo con el Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia reglamentos para la experimentación animal. Todos los procedimientos de este protocolo deben realizarse de acuerdo con el requerimiento de la Comisión correspondiente Cuidado de Animales y Ética. 1. La acetilcolinesterasa histoquímica tinción Prep…

Representative Results

La acetilcolinesterasa tinción histoquímica revela la localización de las placas extremas del motor a través de la anchura de los músculos. Figura 1 ilustra los resultados de tales tinción realizado en toda una extremidad anterior de rata. Se sugiere para optimizar la concentración de la solución de sulfuro de amonio (por ejemplo., 5-7% en lugar del 10%), así como el tiempo de la muestra se sumerge en la solución si la tinción de fondo no específica en las fibras de músculos es dem…

Discussion

Focalización intramuscular y transferencia retrógrada posterior de transgenes terapéuticos a los correspondientes motoneuronas α para el tratamiento experimental de la condición neuromuscular no es una estrategia nueva. Por ejemplo, este método de entrega se ha utilizado para retrasar la degeneración neuromuscular en diferentes etapas de la progresión de la ALS en ratones y ratas SOD1 1,9-12 así como en ratones con SMA 13. Aunque prometedor, la eficacia de estos escenarios de terapia géni…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por un Centro de Investigación de Medicina y Salud Nacional (NHMRC) subvención para el proyecto de RM

Materials

Fluoro-Gold Fluorochrome, LLC Nil Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10µl Drummond Scientific 5-000-1001-X10 accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide Sigma Life Science A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous Sigma-Aldrich 61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura Finetek 25608-930
Glycine Ajax Finechem 1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin Life Technologies D-3312 Diliuted in distilled water
Isothesia Provet ISOF00 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9mm Wound Clips Texas Scientific Instruments, LLC 205016
Lethabarb Enthanasia Injection Virbac (Australia) Pty Ltd. LETHA450
Formaldehyde Solution Ajax Finechem A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides Menzel-Glaser J1800AMNZ
Ammonium Sulphide Sigma-Aldrich A1952 Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) Astrazenca Diluted to 0.25%

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Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons. J. Vis. Exp. (101), e52846, doi:10.3791/52846 (2015).

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