Long-term dyrket interferon-γ enzymbundet immunospot assay blir anvendt som et mål på sentralhukommelsesresponser og korrelerer med beskyttende antimykobakteriell vaksine responser. Med denne analysen, er perifere mononukleære blodceller stimulert med mykobakterielle antigener og interleukin-2 i 14 dager, som muliggjør differensiering og utvidelse av sentrale minne-T-celler.
Effektor og hukommelse T-celler er generert gjennom utviklings programmering av naive celler etter antigen anerkjennelse. Hvis infeksjonen er under kontroll inntil 95% av T-celler som genereres under ekspansjonsfasen er eliminert (ie., Sammentrekning fase) og minne T-celler forblir, noen ganger i en mannsalder. Hos mennesker har to funksjonelt distinkte undergrupper av T-celler minne blitt beskrevet på grunnlag av ekspresjon av lymph node homing reseptorer. Sentrale hukommelses T-celler uttrykker CC kjemokinreseptor 7 og CD45RO og er hovedsakelig lokalisert i T-celleområder av sekundære lymfeorganer. Effector minne T-celler uttrykker CD45RO, mangler CCR7 og vise reseptorer forbundet med lymfocytter homing til perifere eller betent vev. Effektor-T-celler ikke uttrykker enten CCR7 eller CD45RO men ved møte med antigen produsere effektor cytokiner, såsom interferon-γ. Interferon-γ frigivelse analyser anvendes for diagnostisering av bovin og human tuberkulose ogoppdage primært effektor og effektor minne T celle responser. Sentrale minne T-celleresponser hos CD4 + T-celler til vaksinering, på den annen side, kan brukes til å forutsi vaksineeffektivitet, som demonstrert med simian immunsviktvirus infeksjon av ikke-menneskelige primater, tuberkulose hos mus, og malaria hos mennesker. Flere studier med mus og mennesker, samt upubliserte data på storfe, har vist at interferon-γ ELISPOT analyser måle sentrale minne T-celle responser. Med denne analysen, perifere mononukleære blodceller dyrkes i avtagende konsentrasjon av antigen i 10 til 14 dager (langtids kultur), slik at effektor responser til topp og avta; tilrettelegge sentrale minne-T-celler til å differensiere og ekspandere i kulturen.
Effektor og minne-T-celler blir generert gjennom utviklings programmering av naive CD4 + T-celler etter antigen gjenkjennelse. Differensiering av naive CD4 + T celler i cytokin produserende celler krever patogen anerkjennelse av medfødte immunceller, antigen presentasjon til T-celler, co-stimulering og transkripsjons endringer som resulterer i polarisert cytokinproduksjon. For eksempel: antigenpresenterende celler produserer interleukin (IL) -12 i respons til intracellulære patogener, som sammen med antigen gjenkjennelse, fremmer differensiering av T-celler til T-hjelper 1 (Th1) -celler 1,2 ved signalisering gjennom signal transduseren og aktivator av transkripsjon 4 (STAT4) og T-box uttrykt i T-celler (T-bet), som fører til celle-aktivering, IL-2-produksjon, klonal ekspansjon og interferon (IFN) -γ produksjon 3,4. Hvis infeksjonen er under kontroll, er opp til 95% av T-cellene som genereres under ekspansjonsfasen fjernet (dvs. sammentrekningfase) og minne T-celler forblir, noen ganger for en levetid 5. Sallusto et al. 6, åpenbarte to funksjonelt distinkte undergrupper av minne-T-celler hos mennesker basert på ekspresjon av lymph node homing reseptorer. Sentrale minne T-celler (TCM) uttrykke CC kjemokinreseptor (CCR) -7 og CD45RO og er hovedsakelig lokalisert i T-celle områder av sekundære lymfoide organer. Tcm har begrenset effektorfunksjon, en lav terskel aktivering og beholde høy IL-2-produksjon og proliferativ kapasitet. Effector minne T-celler (TEM) uttrykke CD45RO, mangler CCR7 og visnings reseptorer for homing til perifere eller betent vev. Effektorceller ikke uttrykker enten CCR7 eller CD45RO men straks produsere effektor cytokiner, for eksempel IFN-γ, ved antigen gjenkjennelse.
IFN-γ utslipp analyser (IGRA) brukes for diagnostisering av bovin og menneskelig tuberkulose 7. Mycobacterium bovis er det viktigste middel for bovin tuberkulose (BTB) mens menneskelig cases av tuberkulose er forårsaket hovedsakelig av Mycobacterium tuberculosis. Med disse tester, helt blod eller perifere mononukleære blodceller (PBMC) stimulert med mykobakterielle antigener i 16 til 24 timer og IFN-γ produksjonen i supernatanten målt ved ELISA eller ved påvisning av celler som produserer IFN-γ ved hjelp av ELISPOT teknikker. Som følge av den korte perioden stimulering (ie., 16 til 24 timer), og hurtig cytokin produksjon, ex vivo-analyser detektere hovedsakelig effektor og Tem responser. Dette har blitt bekreftet av strømningscytometrisk analyse av cellepopulasjoner i disse kulturene 8-10.
Ex vivo-IFN-γ responser blir rutinemessig inkludert i immunresponsen panel evaluering av tuberkulose vaksiner, inkludert de som brukes til å evaluere responser hos storfe. De fleste effektive storfe tuberkulosevaksiner lokke fram konkrete IFN-γ svar, men ikke alle vaksiner som induserer IFN-γ responser er Skyddse. Også nivåer av IFN-γ utløst ved vaksinasjon, målt før infeksjon, ikke nødvendigvis korrelerer med beskyttelse. For eksempel kan ulike BCG-stammer har ulike kapasiteter for å indusere ex vivo IFN-γ respons, på tross av lignende beskyttelsesnivå 11. Dermed ex vivo IGRAs er verdifulle for tuberkulose diagnose og for å få tilgang til vaksine immunogenisitet; derimot, er deres bruk som predikator for vaksineeffekt begrenset. TCM respons på vaksinering, på den annen side, kan brukes til å forutsi vaksineeffektivitet, som demonstrert med simian immunsviktvirus (SIV) infeksjon hos ikke-humane primater 12,13, tuberkulose hos mus 14 og malaria hos mennesker 15,16.
Etter en effektiv immunrespons som resulterer i patogen clearance, blir Tcm vedlikeholdes og gi beskyttelse til en eventuell andre infeksjon av det samme middel. Et bemerkelsesverdig unntak til dette scenariet er M. tuberkulose infeDette skjer av mennesker der pasienter som får kurativ antimykobakteriell terapi er utsatt for re-infeksjon 17,18. I tillegg hendelser styrende immunologisk minne under kroniske infeksjoner, hvor antigenstimulering vedvarer, er ikke godt forstått 19. Under kroniske infeksjoner, for eksempel med humant immunsviktvirus (HIV) og tuberkulose, er en betydelig Tcm respons forbundet med et positivt resultat (for eksempel ventetid med tuberkulose og subklinisk sykdom med HIV) 20,21. Flere studier med mus og mennesker har vist at langtids dyrkede IFN-γ ELISPOT analyser måle Tcm svar 16,20-22. Med denne analyse PBMC dyrket i avtagende konsentrasjon av antigen i 10 til 14 dager, slik at effektor responser til topp og avta; tilrettelegge Tcm å differensiere og utvide i kulturen.
Long-term dyrkede IFN-γ ELISPOT-analyser har også vært anvendt i veterinærforskning, men fenotypen til responderende celler som har vært vanskelig å bedømme på grunn av en mangel på kritiske reagenser, spesielt et antistoff til CCR7. Effektive storfe tuberkulosevaksiner [eg. ved hjelp av en enkelt dose av M. bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), etterfulgt BCG av viral-vectored Antigen 85A subenhetsvaksine eller dempes M. bovis ΔRD1] lokke fram langsiktige kultur IFN-γ ELISPOT svar etter vaksinasjon som korrelerer med beskyttelse (dvs. lavere mycobacterial byrde og redusert TB-assosiert patologi) mot senere utfordring med virulent M. bovis 23,24. Videre antall antigen-spesifikke IFN-γ-sekresjon celler innenfor langsiktige PBMC kulturer er høyere på 12 måneder, men reduseres i 24 måneder etter BCG-vaksinasjon av nyfødte kalver, korrelerer med graden av beskyttelse påviselig post M. bovis utfordring 25. I dette scenariet, er kultivert IFN-γ ELISPOT enn viktig verktøy for å forutsi vaksineeffekt, noe som gir et middel til å prioritere vaksinekandidater for høye kostnader effektstudier. I tillegg kan dyrkede ELISPOT teknikker tilpasses for forskjellige verter, patogener og cytokiner ved å forandre antigener eller antistoffer for en rekke formål i forskjellige forskningsfelt.
IFN-γ produksjonen i langsiktige kultur ELISPOT-analyser er vanligvis på grunn av Tcm hos mennesker, men hvordan dette svaret utvikler seg i kulturen er dårlig forstått. Enten Tcm er til stede i sirkulasjon og ekspandere in vitro, eller hvis TCM reaksjoner skyldes differensiering av effektor og Tem celler til Tcm under kultur er ikke kjent. Men studier med prøver fra mennesker har funnet ut at CD4 + T-celler fra ex vivo og langsiktige kultivert IFN-γ ELISPOT-analyser har urelaterte epitope særegen, noe som tyder på at Tcm svar ikke utvikle seg fra effektorcellene 28. Selvfølgelig kan varigheten av responsen variere, men hvis patogen clearance er oppnådd, eventuelt både ex vivo og TCM responser avta. Også svarene av langsiktige kulturer målt tidlig og lenge etter antigen priming (når effektor responsen er lavere) er vist å korrelere, noe som indikerer at sirkulerende Tcm populasjoner tidlig og lenge etter antilende priming forblir beslektet in vivo. På den annen side, gjør størrelsen av ex vivo-respons ikke ut til å være relatert til størrelsen av minnerespons 29. Disse resultater antyder at langtids dyrkede IFN-γ ELISPOT responser resulterer fra in vitro ekspansjon av TCM og en tilhørende avtagende av effektor-responser i prøven, i stedet for differensiering av effektorceller i Tcm fenotype.
Med storfe, er det relative bidraget av effektor og hukommelse delmengder til responser som detekteres av langsiktige IFN-γ ELISPOT-analysen ikke kjent. Nyere studier tyder på en sammenheng mellom vaksine fremkalte langsiktige kultur IFN-γ ELISPOT svar og beskyttelse mot senere eksperimentell infeksjon med M. bovis 23-24. Det har blitt rapportert at svake langtids IFN-γ ELISPOT respons på vaksinering er forbundet med fraværet av beskyttelse 30. Både live og drepeed vaksiner indusere lignende ex vivo IFN-γ ELISPOT svar, men vaksinering med levende BCG utløser sterkere langsiktig kultur IFN-γ ELISPOT svar enn gjør drept vaksinepreparater. Interessant, levende vaksiner er beskyttende mens drept formuleringer unnlater å gi beskyttelse mot utfordring med virulent tuberkuløs mykobakterier 31-32, 33.
Vurdering av Tcm responser er også mulig ved å sortere disse cellene fra PBMC. Direkte berikelse av Tcm fra PBMC krever imidlertid dyre enheter, høyt utdannede personlig og er vanskelig som disse cellene er ikke mange i blodet. Langsiktig kultur av PBMC gir berikelse av Tcm løpet Tem og effektorcellene uten dyre enheter; Men fordi disse T-cellepopulasjoner blir ekspandert in vitro de kan være mindre representativ for in vivo hukommelsesresponser. Det er mulig å få tilgang til IFN-γ hukommelsesresponser (ved hjelp av langvarig kultur eller Tcm slaging strategier) av andre enn ELISPOT analyser som: cytokin ELISAer 34, cytokin perle arrays (CBA), intracellulær farging (ICS), eller cytokin protein arrays (CPA). Disse metodene; men er generelt mindre følsomme enn ELISPOT-analysene 35.
En fordel med ELISPOT er dens evne til å detektere den umiddelbare fangst av cytokinet kort tid etter at den ble sluppet hindre fortynning i supernatanten og nedbrytning ved enzymatisk spaltning eller cytokin opptak av andre celler. ELISPOT-analyser detektere enkeltceller produserer cytokiner som gir nøyaktige resultater selv i svakt signal til støy scenarier (dvs. lave spesifikke responser) 35. Også, med ICS, kan påvisning av cytokiner før frigjøring resultere i falske identifikasjon av celler som produserer cytokiner (f.eks., På grunn av post-translasjonell modulasjon før eller under den sekretoriske prosess) 34. Transport hemmere ansatt med ICS-analyser for å minimere cytokinsekresjonunder antigen stimulering (kjent som Golgi-trinns-proteiner) for å begrense varigheten av cellestimulering på grunn av celletoksisitet av disse proteinene til slutt påvirker cytokinproduksjon 35.
Med det sagt – CBA, CPA og ICS er nyttige teknikker for måling av flere cytokiner samtidig og / eller for å bestemme celleoverflatemarkør ekspresjon (dvs. med ICS.). Derfor kan disse metodene bli anvendt i kombinasjon med IFN-γ ELISPOT-analyse 36. Mens tidligere bovin tuberkulose vaksine effektstudier målt Tcm svar via ELISPOT analysen, vil påvisning av Tcm svar av andre teknikker sannsynlig gi sammenlignbare resultater. Viktigere er ELISPOT-analysen mindre kostbart og enklere å utføre enn CBA, CPA og ICS analyseteknikker 34. Manuell telling av SFC er et alternativ til automatisk telling, og ELISPOT plater kan lagres ved romtemperatur i lengre tid med minimalt tap av kvalitet, før eller etter stedet counting 37.
Den langsiktige kultivert IFN-γ ELISPOT responsen har vært brukt for å vurdere minne svar av menneskelig og kyr ved vurdering av tuberkulose vaksine svar 14-16,31-32,33. Tcm svar antas også å spille viktige roller i verts svar på flere andre smittestoffer fra storfe, som for eksempel:. Mycoplasma mycoides subsp mycoides 42, Anaplasma Marginale 38 og bovin respiratorisk syncytialt virus 39. Potensielt kan på lang sikt ELISPOT-analyse tilpasses for andre dyrearter, cytokiner og infeksjoner. Disse bredere søknader vil være spesielt nyttig for veterinær immunologi applikasjoner grunnet dagens begrensede tilgjengeligheten av spesifikke reagenser.
Tcm svar er avgjørende for beskyttelse mot flere infeksjoner, men måle dem tidlig etter infeksjon / immunisering (for sykdom utfallet prediksjon eller vaksineeffekt) may være tungvint. Analyse av immunresponsen i henhold til ex vivo og korte antigenstimulering forhold vil oftere representere effektor reaksjoner, på grunn av overlappingen av hukommelse og effektor-reaksjoner, spesielt i begynnelsen av immunologisk hukommelse formasjonen. I sammenheng med kroniske sykdommer hvor antigenet lasten er kontinuerlig, vil ex vivo responser vurdere effektor-cellere eller en kombinasjon av hukommelse og effektor-celle responser. Den langsiktige dyrket IFN-γ ELISPOT-analyse, som er beskrevet her, sannsynligvis muliggjør måling av TCM responser i stedet for effektor-T-celle-eller kombinerte CD4 + T-celleresponser. Oppsummert gir langvarig dyrket IFN-γ ELISPOT-analyse en verdifull metode for estimering T-celle hukommelsesresponser og har vært anvendt med hell for å evaluere hukommelsesresponser av flere arter av en rekke infeksjoner midler 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.
The authors have nothing to disclose.
Forskning ble støttet av USDA, ARS Cris: 3625-32000-104 og Landbruks- og matdepartementet Forskningsinitiativet Competitive Grant no. 2011-67015-30736 fra USDA National Institute of Food and Agriculture. Vi takker Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen, og Tracy Porter for deres utmerkede teknisk assistanse samt Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille, Jay Steffen, David Lubbers Robin Zeisness, og David Panthen for utmerket omsorg og behandling av dyr.
Sodium citrate (dihydrate) | Various | ||
Citric acid (monohydrate) | Various | ||
Dextrose | Various | ||
ELISPOT PVDF plate | Various | ||
Vectastain ABC – AP KIT Standard | Vector Laboratories | AK-5000 | |
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5300 | |
Ag85A | Lionex | LRP-0004.3 | 23, 24, 25, 37 |
TB 10.4 | Lionex | LRP-0061.6 | 23, 24, 25, 37 |
PPDb | Prionics AG | 7600055 | |
rESAT-6:CFP10 | Kind gift Dr. Minion, Iastate | 23, 24, 25, 27, 37 | |
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 | Serotec | MCA1783B | 23, 24, 25, 27, 37 |
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 | Serotec | MCA2112 | 23, 24, 25, 27, 37 |
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 | Serotec | MCA1653GA | |
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A | Serotec | MCA2434GA | |
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 | Abcam | ab95665 | |
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 | Serotec | MCA1783PE | |
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 | Invitrogen | A-21130 | |
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 | SouthernBiotechnology | 1080-193 | |
Goat anti-rat IgG-APC | Invitrogen | A10540 | |
BD Cytofix/Cytoperm™ | BD Biosciences | 554714 | |
BrefeldinA | Sigma-Aldrich | B7651 | |
Pokeweed Mitogen | Sigma-Aldrich | L8777 | |
Recombinat human Interleukin 2 | Sigma-Aldrich | I7908 |