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Inmunología y contagio

소에 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 평가하기위한 장기 배양 인터페론-γ 효소 링크 된 Immunospot 분석의 응용 프로그램

Published: July 11, 2015
doi:
10.3791/52833
, , , , , ,
1Infectious Bacterial Diseases Research Unit, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service,United States Department of Agriculture, 2Department of Veterinary Pathology, College of Veterinary Medicine,Iowa State University, 3UK Veterinary Laboratories Agency, 4Visual Services, National Centers for Animal Health, Animal and Plant Health Inspection Service,United States Department of Agriculture

Summary

장기 배양 인터페론 γ 효소 – 결합 된 Immunospot 분석은 중앙 메모리 응답의 척도로서 사용하고 보호 항 미코 박테리아 백​​신 응답과 상관된다. 이 분석을 통해, 말초 혈액 단핵 세포는 마이코 박테리아 항원과 인터루킨 -2 14 일 동안 활성화, 분화 및 중앙 메모리 T 세포의 확장을 자극.

Abstract

이펙터 메모리 T 세포는 항원 인식 다음 순진한 세포의 발달 프로그래밍을 통해 생성된다. 감염이 팽창 단계 동안 생성 된 T 세포의 95 %까지 제어되는 경우 제거된다 (예., 수축 단계) 및 메모리 T 세포는 때때로 제품 수명 동안 유지. 인간에서, 메모리 T 세포의 두 가지 별개의 기능적 서브 세트 림프절 호밍 수용체의 발현에 기초하여 설명되었다. 중앙 메모리 T 세포는 CC 케모카인 수용체 (7)와 CD45RO 표현 주로 차 림프 기관의 T 세포 지역에 위치하고있다. 이펙터 메모리 T 세포는 CD45RO 표현 염증 또는 말초 조직에 임파구 호밍 CCR7과 연관된 디스플레이 수용체 결여. 이펙터 T 세포는 CCR7 또는 CD45RO하지만 인터페론-γ와 같은 항원 생산 이펙터 사이토 카인과의 만남에 하나를 표명하지 아니합니다. 인터페론 γ 방출 분석법 인간 소 결핵 진단에 사용되며주로 효과기 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 검출한다. 인간 유인원 면역 결핍 바이러스의 비 – 인간 영장류의 감염, 결핵 생쥐 및 말라리아 있듯이 접종 CD4 + T 세포에 의해 중앙 메모리 T 세포 반응은, 다른 한편으로, 백신 유효성을 예측하는데 사용될 수있다. 생쥐와 인간뿐만 아니라 가축에 게시되지 않은 데이터와 여러 연구, 인터페론 γ의 ELISPOT 분석은 중앙 메모리 T 세포 반응을 측정하는 것을 증명하고있다. 이 분석을 통해, 말초 혈 단핵 세포, 10~14일 (장기간 배양)에 대한 항원의 농도를 감소 효과기 응답 피크와 약 해지는 것을 허용에서 배양; 중앙 메모리 T 세포를 촉진하는 차별화 문화 내에서 확장합니다.

Introduction

이펙터 및 메모리 T 세포는 항원 인식 후의 나이브 CD4 + T 세포의 발달 프로그래밍을 통해 생성된다. 사이토 카인 생산 세포 내로 나이브 CD4 + T 세포의 분화는 선천성 면역 세포, T 항원 제시 세포 공동 자극과 편광 사이토킨 생성으로 인한 전사 변경하여 병원체 인식을 요구한다. 예를 들어 항원 제시 세포를 함께 항원 인식과 함께, 신호 변환기와의 활성화를 통한 신호에 의해 T 헬퍼로 1 (받은 Th1) 세포 1,2 T 세포의 분화를 촉진하는 세포 내 병원체에 응답하여 인터루킨 (IL) -12을 생산 전사 4 (STAT4)와 T-상자가 세포 활성화, IL-2 생산, 클론 확장 및 인터페론 (IFN) -γ 생산 3,4로 이어지는, T 세포 (T-BET)로 표현. 감염이 제어되는 경우 팽창 단계 동안 생성 된 T 세포의 최대 95 % (즉, 수축을 제거상) 및 메모리 T 세포는 평생 5 때로는 남아있다. Sallusto 등. 6, 림프절 유도 수용체의 발현을 기반으로 인간의 메모리 T 세포의 두 기능적으로 별개의 부분 집합을 밝혔다. 중앙 메모리 T 세포 (TCM)는 CC 케모카인 수용체 (CCR) -7 및 CD45RO을 표현하고 주로 차 림프 기관의 T 세포 지역에 있습니다. TCM은 효과기 기능, 낮은 활성화 임계치와 높은 IL-2 생산 및 증식 능력을 보유 제한. 이펙터 메모리 T 세포 (TEM)는 CD45RO을 표현 주변이나 염증 조직에 원점 복귀 CCR7 및 디스플레이 수용체 부족하다. 이펙터 세포는 CCR7 또는 CD45RO를 표현하지만 신속 항원 인식에 따라, 이러한 IFN-γ와 같은 이펙터 사이토 카인을 생산하지 않습니다.

IFN-γ 자료 분석 (IGRA)는 소와 인간의 결핵 (7)의 진단에 사용된다. 우형 결핵균은 인간의 캘리포니아 동안 소 결핵 (BTB)의 주요 에이전트결핵의 SES는 결핵균에 의해 주로 발생합니다. 이러한 테스트 전혈 또는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)를 ELISA 또는 ELISPOT 기술을 사용하여 IFN-γ를 생산하는 세포의 검출을 통해 측정되는 16 시간 상등액 내의 IFN-γ 생산을 24 대 마이코 박테리아 항원에 의해 자극된다. 짧은 기간 자극의 결과로서 (즉. 16, 24 시간) 및 신속한 사이토 카인 생성, 생체 외 분석은 주로 효과기과 Tem의 응답을 검출한다. 이는 이들의 배양 8-10 세포 집단의 유세포 분석에 의해 확인되었다.

생체 외 IFN-γ 반응은 통상적으로 소에 의한 응답을 평가하는 것을 포함 결핵 백신의 면역 반응 패널 평가에 포함된다. 가장 효과적인 소 결핵 백신은 특정 IFN-γ 반응을 유도 아니라 IFN-γ 반응을 유도하는 모든 백신은 protectiv전자. 또한, 감염 전에 측정, 예방 접종에 의해 유발 IFN-γ의 수준은 반드시 보호와 상관 관계가 없습니다. 예를 들어, 다른 BCG 균주와 유사한 보호 수준 (11)에도 불구하고, 생체 IFN-γ 반응을 유도하는 서로 다른 용량을 가질 수도있다. 따라서, 생체 IGRAs 결핵 진단 및 백신의 면역 원성에 액세스하는 가치가있다; 그러나, 백신의 효능 예측로서의 용도가 제한된다. 인간 15,16 쥐에서 (14) 및 말라리아의 비 – 인간 영장류 (12, 13), 결핵 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV) 감염에 대한 백신 접종 있듯이 TCM 응답은, 다른 한편으로, 백신의 유효성을 예측하는데 사용될 수있다.

병원체 클리어런스 결과 효과적인 면역 반응 후, TCM이 유지되고 동일한 에이전트에 의해 최종 번째 감염에 대한 보호를 제공한다. 이 시나리오에 주목할만한 예외는 M.입니다 결핵 infe인간의 ction의가있는 치료 항 마이코 박테리아 치료를받은 환자는 다시 감염에 17, 18를 민감하다. 또한, 만성 감염시 면역 학적 기억을 관장하는 이벤트는, 항원 자극이 지속되고, 잘 (19)을 이해하지 않습니다. 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 및 결핵 등의 만성 감염 동안 상당한 TCM 응답은 양호한 결과 (20, 21) (결핵 및 HIV와 무증상 질환 예 레이턴시)와 관련된다. 마우스 및 인간과 몇몇 연구는 장기 배양 IFN-γ ELISPOT 분석이 TCM 응답 16,20-22을 측정하는 것을 증명하고있다. 이 분석을 통해, PBMC를 10 내지 14 일 동안 항원의 농도를 감소 효과기 응답 피크와 약 해지는 것을 허용에서 배양; TCM을 촉진하는 차별화 문화 내에서 확장합니다.

장기 배양 된 IFN-γ의 ELISPOT 분석은 또한 수 의학적으로 이용되어왔다연구, 아직 응답 세포의 표현형 인해 중요한 시약의 부족, CCR7 특히 항체 평가하기가 어려웠다. 효과적인 소 결핵 백신 [예. M.의 단일 투여 량을 사용하여 우형 바실 칼 메트 GUERIN (BCG)은 BCG는 우형 ΔRD1] 보호와 상관 관계가 예방 접종을 다음과 같은 장기 배양 IFN-γ ELISPOT 응답 (즉, 낮은 마이코 박테리아 부담을 유도. 바이러스-벡터화 항원 85A 서브 유닛 백신, 또는 감쇠 M 다음과 감소 TB-관련된 병리학) 악성 엠 후속 과제에 대하여 우형 (23, 24). 또한, 장기 PBMC 배양 물 내 항원 특이 적 IFN-γ 분비 세포의 수를 12 개월 이상이지만 보호 검출 포스트 M.의 정도와 상관 신생아 송아지 BCG 예방 접종 후 24 개월 째 감소 우형 도전 25. 이 시나리오에서, 배양 된 IFN-γ는 ELISPOT이고백신 효능을 예측 고비용 효능 시험에 대한 백신 후보의 우선 순위를 제공하기위한 수단을 N 중요한 도구. 또한, 배양 ELISPOT 기술들은 다양한 연구 분야에서 다양한 목적으로 항원 또는 항체를 변경함으로써 다양한 호스트, 병원균 및 사이토킨에 대해 적응 될 수있다.

Protocol

1. 다음 솔루션을 준비 완전 RPMI (cRMPI) 10 % (부피 / 부피)의 농도, 글루타민 (2 μM), 나트륨 피루 베이트 (1 μM), 비 필수 아미노산 (0.1 μM), 페니실린에 소 태아 혈청 (FBS)를 첨가하여 준비 -streptomycin (100 단위 / ml의 페니실린, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신) 및 RPMI 1640에 2- 메르 캅토 에탄올 (50 mm)이다. 증류수에 구연산 나트륨 (77 μM), 시트르산 (38 μM), 및 덱 스트로스 (122 μM)을 혼합하여,이 X 산 시트 레이트 덱스 트로 오스를 준비한다. 준비 칼슘 마그네슘 2 + 무료 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.2 : 염화나트륨 (137 mM)을의 KCl (2.7 mM)을, 나 2 HPO 4 (이염, 10 mM의), KH 2 PO 4 (염기, 2 mM의) 증류수; 7.2로 pH를 조정합니다. PBS (중량 / 부피, PBS의 1g / 100 ㎖)으로 소 혈청 알부민을 첨가하여 1 %를 PBS (PBS, 1 % BSA)을 준비한다. PBS + 0.05 % 트윈 20을 준비PBS (볼륨 / 볼륨, 트윈의 500 μL의 PBS 1분의 20 패)로 0.05 % 트윈 20을 추가하여 (PBST). 증류수에 트리스 (100 mM)을 염산 (0.50 mm)를 혼합하여 100 mM 트리스 HCL 산도 8.2 버퍼를 준비합니다. (35 에틸 알콜 ㎖ / 100 ml의 증류수, 부피 / 부피)을 증류수에 에틸 알콜 (순도 ≥99.5 %)을 희석하여 35 % 에탄올 용액을 준비한다. 필터 cRPMI, 2 × 산 시트 레이트 덱스 트로 오스, PBS, PBS 0.22 μm의 필터를 사용하여 1 % BSA를 살균. 2. 장기 배양 된 세포 (14 일 프로토콜) (날 일) cRPMI에 두 번 최종 농도의 항원 솔루션을 준비합니다. 항원의 선택은 중요하며, 연구의 목적에 맞게 조정되어야한다. 재조합 M. 희석 (각 항원, 최종 농도가 1 μg의 / ㎖이다) 결핵은 2 μg의 / ㎖로 TB10.4 항원 Ag85A를 항원. 희석 M. 우형 정제 된 단백질 유도체10 ㎍ / ㎖의에 (PPD-B, Prionics AG) (최종 농도 5 μg의 / ㎖)입니다. 2 ㎍ / ㎖의 (1 μg의 / ㎖의 최종 농도) : 재조합 초기 분비 항원 목표 6 (ESAT-6)과 문화 여과 단백질 10 (CFP-10) 융합 단백질을 (CFP10 rESAT-6) 희석. 참고 :이 항원은 결핵성 마이코 박테리아의 항원을 유도하는 면역 IFN-γ하고 엠에서 PBMC를 자극하기 위해 포함 할 수있다 우형 동물을 감염 시켰습니다. BCG 또는 M. 이 균주에 삭제 (즉, RD1)이 항원을 코딩하는 영역으로, CFP10 : 우형 ΔRD1 동물이 rESAT-6이 응답하지 않는 예방 접종. rESAT-6 :이 연구에 사용 된 CFP10 박사 C. 미니언, 아이오와 주립 대학에서 일종의 선물이었다. TB10.4 및 항원 Ag85A는 악성 백신 (M)에 존재하는 면역 항원은 우형는 37 균주. PPDB는 정제 된 단백질 유도체로서, 비 결핵성 항산 균 항원과 공유 등 여러 항원 복합체이다. 인 감염CFP10 11 : 백신 접종 동물 rESAT-6에 응답하지 말아야하는 동안, (CFP10 및 PPDb : ​​TB10.4),은 (Ag 85A, rESAT-6, 즉) 테드 동물은 잠재적으로 모든 항원에 반응 할 것이다. 플레이트 500 μL / 24 웰 플레이트에 각 동물에 대한 quadruplicates에서 항원 솔루션의 잘. 이 프로토콜의 경우, 풀 등의 항원을 사용; 따라서 모든 우물 모든 항원이 단계 (예를 들면, null 또는 미토 겐 등)없이 컨트롤을 포함 사용할 수 있습니다. 39 ° C / 5 % CO 2에서 판을 품어. 가축의 정상 온도는 39 ° C이다 따라서, 일부 연구자들은 소 세포의 배양을위한 39 ° C를 사용한다. 또한, 인간의 세포와 어떤 경우에, 39 ° C에서 세포 배양은 혜택 26,30를 추가 제공합니다. 이 X 산 – 시트 레이트 – 덱 스트로스 6 ㎖의 16 또는 18 G 피하 주사 바늘과 함께 미리로드 주사기; 과 경정맥 정맥 천자에 의해 소 혈액 60 ml의를 수집합니다. 말초 혈액 버피 코트 분획의 표준 밀도 구배 원심 분리에 의해 PBMC를 분리Maue 등에 의해 기술 된 바와 같이 4 × 106 세포 / ml의 세포 농도를 조정. 27 항원으로 세포를 (500 μL / 웰) 추가는 각 동물 (단계 2.5)에 대해 4 번씩, 24 웰 플레이트를 미리로드. 39 ° C / 5 % CO 2에서 판을 품어. (일 세 일곱) 멸균 기법을 사용하여 조심스럽게 전지 층을 방해하지 않고, 각 웰로부터 상등액 500 μL를 제거한다. IL-2를 포함하는 500 μL / 추가 잘 cRPMI에 의해 잘 볼륨을 보충 (물론 즉, 30 U / μL, 15 U /를 재조합 인간 IL-2 시그마 I7908). 39 ° C / 5 % CO 2에서 판을 품어. (10 일 및 12) 무균 기술을 사용하여, 각 우물에서 뜨는 750 μl를 제거합니다. (IL-2)없이 750 μL / cRPMI 잘 사용하여 볼륨을 보충. 39 ° C / 5 % CO 2에서 판을 품어. <p클래스 = "jove_title"> 3. ELISPOT 분석 (삼일 프로토콜) (주 하나 (장기 문화 프로토콜의 12 일 일)) 셀을 도금 할 때 실수를 방지하기 위해, 각 샘플 세트에 대해 적절히 ELISPOT 플레이트 레이블 : 장기 셀 플러스 장갑차 및 생체 외 / 단기 세포없이 항원 제시 세포 (APC를), 장기 세포 (도 1). 중복 적어도 수행해야합니다 각각의 치료 (즉 항원 자극)에 대한 복제합니다. PBS에서 마우스 항 – 소 IFN-γ 항체 (MCA2112, 복제 CC330) (8 μg의 / ml)에 희석하여 캡처 항체 솔루션을 준비합니다. 멀티 채널 피펫 사용하여 1 분 / 웰의 35 % 에탄올과 15 ㎕의 ELISPOT 플레이트의 웰을 프리 – 습윤. 멤브레인의 손상을 방지하기 위해, 분석하는 동안 어느 시점에 피펫 팁 우물의 바닥을 만지​​지 마십시오. 세탁 판의 PBS 300 μL / 잘 여섯 번. 워시 액은 판 반전에 의해 폐기해야. 세척이 판 우물이 건조 허용하지 않는, 신속하게 수행해야합니다. (1 단계 위의) 캡처 방지 IFN-γ 항체의 피펫 100 μL / 웰. 4 ° CO / N (지퍼 스토리지 가방 내부의 판을 유지)에 품어. (두 주 (장기간 배양 프로토콜의 13 번째 날)) 두 번 최종 농도에서 항원 솔루션을 준비합니다. 치료는 다음과 같습니다 : 더 자극 (cRPMI), PPD-B (20 ㎍ / ml의 최종 농도 10 μg의 / ㎖), TB10.4의 단백질 칵테일 및 Ag85A (각 단백질의 2 ㎍ / ml의 최종 농도 : 1 μg의 / 각 단백질 ㎖) rESAT-6 : CFP10 (M. 보비스 감염, 2 μg의 / ml의 최종 농도 : 이러한의 pokeweed (20 ㎍ / ml의 최종 농도로서 1 μg의 / ㎖) 및 양성 대조군 : 10 μg의 / ㎖). 대신 다른 분열 촉진 (예를 들면, 콘 카나 발린 A) PWM 사용될 수있다. 참고 :이 단계에서 항원 네 가지 트리트먼트를 구성 및 n은OT (단계 2.5에서와 같이) 풀로 사용. 네 치료는 다음과 같습니다 NS, PPDb, 단백질 칵테일 (TB10.4 및 Ag85A 한 처리를 구성) 및 PWM. 4. 단기 세포 배양 및 자기편 세포 (장갑차) 분리 (아래 : 장기 배양 14 일 프로토콜) 1 일에 출혈 같은 동물에서 60 ml의 혈액을 수집하고 이전 PBMC를 격리. 2 × 106 세포 / ml의 농도로 세포를 조정한다. 셀을 도금 할 때 라벨 튜브 명확 잘못 분배를 방지 할 수있다. 이 세포들은 단기 세포 배양 (단계 6.5) 또한 장갑차 분리에 사용된다. 동물의 수와 (: 생체, 단기 또는 신선한 셀이 경우) 문화의 유형 모두 레이블 튜브. 판 반전에 의해 ELISPOT에서 초과 캡처 항체를 제거합니다. 플레이트 300 μL의 PBST로 6 회 반복한다. 가능한 한 많은 PBST를 제거합니다. 피펫 장기 세포 플러스 장갑차로 표시 웰에 세포 현탁액 50 μL. 블록 다른 아cRPMI 200 μL / 웰와 LS. (90)에서 분 또는 39 ° C를 품어 사전 따뜻한 cRPMI 또는 39 ° C의 (후속 단계에 필요한). 자기편 세포 (장갑차) 분리에 사용되지 신선한 PBMC를은 다음 단계에서 필요하고 보관해야합니다. 5. 배양 세포 90 분 배양 (단계 4.4, 단기 문화와 자기편 세포 분리 단계), 수확 장기 배양 된 세포 중. 위아래 세포 5 또는 10 μL 피펫, 피펫 미디어를 사용하여 사통은 단일 15 ML 튜브에 각 동물에서 복제 결합, 세포를 분리합니다. 400g에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기. 원심 분리 후, 튜브를 반전하여 상층 액을 버린다. 세포 펠렛을 제거. 필요한 경우 부드럽게, 펠렛을 다시 중단, PBS의 5 ML을 추가합니다. 원심 분리를 반복합니다. 두 번 세척 단계를 반복합니다. 1ml를 cRPMI 세포를 일시 중지 다시 부드럽게 튜브 반전에 의해 상층 액을 버리고. 세포 농도를 조절2 X 105 세포 / ㎖이다. 6. 도금 신선한 배양 PBMC를 90 분 부화 후, 30 초 동안 접시 통에 판을 흔들. 판 반전에 의해 비 부착 세포를 제거합니다. 피펫 150 μL / 따뜻한 cRPMI 잘 (아래 4 단계에서 : 단기 세포 및 부착 세포 (장갑차) 분리 공정). 판을 흔들어 세척 유체를 폐기합니다. 반복 세탁 3 회. 100 μL / 웰의 적절한 우물에 각 항원을 추가 (미리 라벨링). 세포를 플레이트에 장기 세포 플러스 장갑차로 표시 웰로 피펫 100 μL / 웰의 장기 배양 세포 현탁액 (2 × 105 세포 / ㎖). APC는 웰에 이미 같이이 단계에서 추가의 장기 세포를 동물로부터 동일한 지 확인. 다른 동물에서 APC의 장기 배양 된 세포를 혼합하지 마십시오. APC없이 우물에 장기 배양 세포 현탁액 피펫 100 μL / 웰 (2 × 105 세포 / ml)장기 배양 응답 APC 요건 평가 S. 100 μL / 웰의 단기 세포 (새로 단리하고 2 × 106 세포 / ml로 조절) 생체 반응 평가를 위해 추가. 39 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 접시 O / N을 품어. 판 평면 거짓말을하고 있는지 확인하고 접시를 쌓아 두지 않는다. 주 : 세포의 표현형 분석을 원하는 경우, 유세포 분석법 부수적으로 수행 될 수있다. 세포 ELISPOT 분석에 기재 한 바와 같이 96 잘 U 바닥 판 (대신 ELISPOT의 판)에 도금되어있다. 캡처 항체 흡착 (3.5 3.4 단계) 생략한다. 세포는 39 ° C / 5 % CO2 및 수행 표준 셀 염색 프로토콜에서 O / N 항온 처리된다. 세포 염색 시약은 시약 테이블에 포함됩니다. 하루 세 (장기 문화 프로토콜의 14 일 일) 검출 항체 (마우스 항 소 IFN-γ, 클론 CC3 희석02) PBS 1 % BSA 5 μg의 / ㎖이다. 우물에서 유체를 버리고 접시 세척 : 추가로 6 시간 전에서 중간 세척, 한 번 DH 2 O (300 μL / 웰), 10 초 동안 진탕마다 배치 PBST로 여섯 번 (300 μL / 웰), PBS로 PBST로 (300 μL / 웰)와 두 배 (300 μL / 웰). 세포가 판에서 제거 된 후 더 바이오 안전성에 대한 우려를 적용하지 않는 경우, 그리고 절차는 생물 안전 캐비닛 외부에서 수행 할 수있다. 폐기 세척액. 종이 타월에 판을 눌러 가능한 한 세척 유체를 제거합니다. 검출 항체를 추가 (100 μL / 웰). 120 분 또는 39 ° C의 번호판을 품어 이 배양 단계에서, 제조업체의 지침에 따라 알칼리 포스 파타 아제 용액을 제조. 사용하기 전에 서른 분 (즉, 우물에 검출 항체를 첨가 한 후 90 분) PBST의 시약을 희석. 시약을 혼합하고 실온에서 배양 부드럽게 튜브를 반전. 12 후0 분 배양 접시, 반전에 의해 초과 검출 항체를 폐기합니다. 워시 플레이트 PBST로 6 회 (300 μL / 웰). 종이 타월에 판을 눌러 가능한 한 세척 유체를 제거합니다. 100 μL / 웰의 (단계 3 위), 알칼리 포스 파타 아제 솔루션을 추가합니다. 실온에서 45 분 동안 접시를 품어. 유체 취소하고 PBST로 각각의 판을 6 회 반복한다 (300 μL / 웰). 제조업체의 지침 (벡터 블루 AP 기판 III를) 다음과 같은 기질 용액을 준비 : 100 mM 트리스 HCL 산도 8.2 버퍼에 시약을 희석. 피펫 50 μL / 기질 용액의 잘. 푸른 색 (약 30 분)을 개발하기 시작 때까지 실온에서 품어. 유체 취소하고 DH 2 O의 풍부한 양의 판을 씻어 , 막 노출 다시 우물 세척 및 건조 공기 판을 할 수 있도록 바닥 플레이트를 제거합니다. 실체 현미경을 사용하여 수동으로 된 Immunospot 이미지 분석기 또는 ELISPOT 리더 (표 1), 또는에 판을 읽어보십시오. 또한, 판을 유지독서 할 때까지 실온에서 어둠 속에서. 때문에, 반응 기질의 높은 안정성, 품질은 수년 동안 보존된다. 주 : 세포 및 항원 농도는 셀 수없는 지점으로 23,24,27,37 웰을 방지하기 위해 최적화되었다. 그것은 셀 수없는 관광 명소 형성이 다른 설정 또는 의한 생물학적 변화에 발생할 가능성이있다. 그 경우라면 판독 스폿 카운팅 응답이 얻어 지도록, 세포 농도가 최적화되어야한다. 7. 접시 읽기 및 데이터 분석 셀룰러 기술 제한 (CTL) ELISPOT 플레이트 리더 가이드 (표 1)에 따라 분석을 수행합니다. 스폿 카운트 각 웰에 대해 획득되면, 중복 사이의 평균을 계산한다. 각각의 자극에 대한 항원 특이 적 면역 반응은 항원 자극 우물의 것과 비 자극 된 웰 반점의 평균 개수를 감산함으로써 계산된다.

Representative Results

엠와 약 한 달 후 에어로졸 감염 보비스 (104 콜로니 형성 단위), PBMC를 감염으로부터 (N = 8)과 대조군 (N = 8) 항원, 13 일 동안 IL-2의 존재하에 배양 하였다. TCM 반응의 개발은 감염 후 IFN-γ ELISPOT 분석법을 사용하여 측정 하였다. (장갑차의 존재 또는 부재) 주제 TCM 및 생체 IFN-γ도 1에 도시되어 감염된 동물 (동물 3 마리)과 감염되지 않은 동물 (사람, 동물)에서 ELISPOT 응답. 성공적인 장기 IFN-γ IFN-γ를 생산하는 세포의 ELISPOT 분석 결과 자극 조건과 비 – 감염된 동물로부터의 응답의 유무에 가까운 비 자극 된 조건 (스팟 형성 세포, SFC). 또한, 강력한 T 세포 반응은 PWM에 응답하여 발생한다. 엠에 특정 응답 CFP10 항원 자극 : 우형은 PPD-B 또는 rESAT-6에 의해 평가되었다. 도면에 도시 된 바와 같이1, 강력한 TCM과 전 PPD-B와 rESAT-6에 대한 생체 반응 : CFP10는 세 엠에서 검출되었다 우형 동물을 -infected. 더 TCM 및 생체 반응을 최소화는 제어 동물에서 검출되었다. 자가 장갑차의 부재 하에서 배양 장기 세포에 의해 크게 감소 반응에 의해 입증 된 바와 같이 또한, 장갑차의 존재는, 감염된 동물 최적 TCM 응답 요구 하였다. M.에서 PBMC를하여 IFN-γ 응답 우형 감염과 감염되지 않은 동물 그림 2에 제시되어있다. 각 동물에서 SFC를 수는 PPD-B 마이너스 형 미디어에 각각의 응답에 대한 응답에 중복 된 샘플에서 SFC를의 평균 개수로 계산 하였다. 응답은 10 6 세포 추정되었다. 응답 차이 (P <0.05), 감염 상태, 또는 존재 장갑차 및 배양 기간 (예., 장기 배양에 비해 생체 외 배양)의 유무에 기초하여. <table border="0" cellpadding = "0"cellspacing = "0"> 판의 영상을 획득 1. 컴퓨터를 켭니다 2. 열기 "면역 캡처"버전 6.3 소프트웨어. 3. 1 단계 : 선택 플레이트 타입. 4. 2 단계 :로드 플레이트. 5. 3 단계 : 검색 옵션을 선택합니다. 6. 4 단계 : 스캔을 시작합니다. 7. 판의 개요 이미지를 가져옵니다. 8. 판을 꺼냅니다. 9. "면역 캡처"소프트웨어를 종료합니다. 현장 형성 단위를 계산 1. "면역 스팟 캡처"버전 5.0 소프트웨어를 엽니 다. 2. 선택 objec T 유형 : 일반. 3. 선택 계산 모듈 : 스마트 수입니다. 4. 1 단계 :로드 플레이트. 5. 2 단계 : 계산 매개 변수를 정의 : 스팟 인식의 테스트 정확도를 다른 관광 명소와 우물에. 6. 자동 카운트를 시작합니다. 품질 관리 1. 열기 "된 Immunospot 캡처"버전 5.0 소프트웨어. 2. 선택 계산 모듈 : 품질 관리. 3. 1 단계 :로드 플레이트. 4. 2 단계 : 개별적으로 강조 우물을 분석합니다. 5. 품질 관리를 마칩니다. 표 1 – AutoImmun Diagnostika ELISPOT 리더 이미지 수집 및 셀은 절차를 계산. ove_content "FO : 유지 – together.within 페이지 ="항상 "> ELISPOT 분석 γ 장기 배양 IFN-에서 우물의 그림 1. 이미지. 배양 된 IFN-γ ELISPOT 분석은 악성 M.와 공격 후 approximatelyone 달 하였다 보비스 (세 동물). 감염되지 않은 동물을 제어 (하나의 동물)에 포함 된 장기 세포주가 재조합 Ag85A (1 μg의 / ㎖) TB10.4 (1 μg의 / ㎖)의 칵테일 PBMC 자극에 의해 생성 된, rESAT -6-. : CFP10 (1 μg의 / mL) 및 PPD-B자가 APC의 존재 또는 부재 ELISPOT 플레이트에 전사 하였다 십삼일 (5 μg의 / ㎖). PBMC 하루 13에 고립 ELISPOT 판에 직접 도금의 단기 세포로 구성되었다. 장기 및 단기 세포는 PPD-B (10 μg의 / ㎖) rESAT-6로 자극했다 : 5 (CFP10 (1 μg의 / ㎖), 배지 단독의 pokeweed 및 미토 겐# 956; g / ml)로 24 시간 동안 가열 하였다. 엠에 ELISPOT 응답 γ 장기 배양 IFN-에서 그림 2. 대표 결과 우형 정제 된 단백질 유도체 (PPD-B). 배양 된 IFN-γELISPOT 분석은 악성 M.와 공격 후 approximatelyone 달 하였다 우형 (팔 동물). 감염되지 않은 동물 여덟 동물 장기 세포를 재조합 Ag85A의 칵테일 (1 μg의 / ㎖) TB10.4 (1 μg의 / mL)로 PBMC를 자극하여 생성 하였다 (대조군으로 포함되었다 rESAT-6 : CFP10 (1 μg의 / mL) 및 PPD-B자가 장갑차의 존재 또는 부재 ELISPOT 플레이트에 전사 하였다 십삼일 (5 μg의 / ㎖). 단기 세포는 PBMC 이루어져 날 (13) 상에 절연 및 ELISPOT 플레이트에 직접 도금 . 장기 및 소RT 장기 세포를 24 시간 동안 단독으로 PPD-B (10 μg의 / ㎖) 또는 배지로 자극 하였다. 각 동물 (SFC / 10 6 세포)에서 특정 응답은 PPD-B (중복 시료의 평균) 마이너스 형 미디어에 대한 응답에 대한 응답으로 표시하고 있습니다.

Discussion

장기 배양 ELISPOT 분석에서 IFN-γ 생산은 인간에서 TCM 때문에 발생하지만,이 응답은 배양 방법을 개발 제대로 이해된다. 여부 TCM 순환에 존재하고 체외에서 확장 또는 TCM 응답 문화 동안 TCM에 이펙터와의 TEM 세포의 분화에 기인하는 경우 알려져 있지 않다. 그러나, 인간의 샘플 연구는 생체 장기 배양 IFN-γ의 ELISPOT 분석에서 CD4 + T 세포가 TCM 응답은 이펙터 세포 (28)에서 개발하지 않는 것이 의미, 관련이없는 항원 특이성을 가지고 있음을 발견했다. 물론, 반응의 지속 기간은 다를 수 있지만 병원체 간극이 달성되면, 결국 모두 생체 TCM 및 응답은 거절. 또한, 장기 문화의 응답이 조기에 긴 항원 프라이밍 후 측정 (이펙터 응답이 낮은 경우)을 나타내는 상관 관계를 나타낸다 그 반대로 후 초기 및 장기 TCM 인구 순환제닉 프라이밍 생체 관련 남아있다. 한편, 생체 반응의 크기는 메모리 응답 (29)의 크기에 관련되는 것으로 보이지 않는다. 이러한 결과는 장기 배양 된 IFN-γ 반응은 ELISPOT TCM의 시험 관내 팽창 및 샘플 이펙터 반응 연관된 쇠퇴보다는 TCM 표현형 이펙터 세포로의 분화의 결과 제안.

가축, 장기 IFN-γ의 ELISPOT 분석에 의해 검출 된 응답에 이펙터 및 메모리 서브 세트의 상대적 기여도는 알려져 있지 않다. 최근의 연구는 백신 사이에 상관 관계가 엠 후속 실험 감염에 장기 배양 IFN-γ ELISPOT 응답과 보호를 이끌어냅니다 우형 23-24. 이는 백신 약한 장기 IFN-γ의 ELISPOT 반응이 보호 부재 (30)와 연관되는 것으로보고되었다. 모두 살고 죽ED 백신은 유사한 생체 IFN-γ ELISPOT 응답을 유도하지만, 라이브 BCG 접종 살해 백신 준비를하는 것보다 더 강한 장기 배양 IFN-γ ELISPOT 반응을 이끌어. 사망 제제가 악성 결핵성 마이코 박테리아 31 ~ 32, 33과 도전에 대한 보호를 제공하는 데 실패하면서 흥미롭게도, 생백신은 보호 있습니다.

TCM 응답의 평가는 PBMC에서 이러한 세포를 정렬하여 가능하다. PBMC에서 TCM 직접 농축 그러나, 고도로 훈련 된 개인 비싼 장비를 필요로하며, 이러한 세포는 혈류 수많은 아니기 때문에 어렵다. PBMC의 장기 문화는 Tem의 고가의 장치없이 이펙터 세포를 통해 한의학의 농축을 제공한다; 이러한 T 세포 개체군은 시험 관내에서 확장되기 때문에, 이들은 생체 내에서 메모리 응답 이하 대표 될 수있다. 그것은 장기 배양 또는 TCM 정렬 방법을 사용하여 (IFN-γ 메모리 응답들을 액세스 할 수있다시토 킨 ELISA를 34 사이토킨 비드 어레이 (CBA), 세포 내 염색 (ICS), 또는 사이토 카인 단백질 어레이 (CPA) 등 이외의 ELISPOT 분석에 의한 전략)을 보내고. 이러한 방법; 그러나, 일반적으로 ELISPOT 35 분석보다 덜 민감하다.

ELISPOT의 장점은 곧 출시가 다른 세포에 의해 효소 절단 또는 사이토 카인 흡수하여 상층 액과 저하 희석을 방지 한 후 사이토 카인의 즉각적인 캡처를 감지하는 기능입니다. ELISPOT 분석도 소음 시나리오 (즉, 낮은 특정 응답) 35 낮은 신호에서 정확한 결과를 제공하는 사이토 카인을 생산하는 단일 세포를 감지합니다. 또한, ICS와 함께, 배포 전에 사이토 카인의 검출은 사이토 카인을 생산하는 세포의 거짓 식별 될 수 있습니다 (예., 인해 분비 과정 전 또는 중에 번역 후 변조) 34. 사이토 카인 분비를 최소화 ICS 분석법으로 사용될 수송 저해제(골지체 정지 단백질로 알려진) 항원 자극시 인해 궁극적으로 사이토킨 생성 (35)에 영향을 미치는 이들 단백질의 세포 독성 세포 자극의 지속 시간을 제한한다.

그렇게 말 – (. 즉, ICS와 함께) CBA, 공인 회계사 및 ICS 및 / 또는 세포 표면 마커의 발현을 결정하는 동시에 여러 사이토 카인을 측정하는 유용한 기술이다. 따라서, 이러한 방법은 IFN-γ ELISPOT 분석 36와 함께 사용될 수있다. 이전 소 TB 백신 효능 연구 ELISPOT 분석 TCM을 통해 응답을 측정하는 동안, 다른 기술에 의해 TCM 응답의 검출 결과를 비교 가능성을 수득한다. 중요한 것은, ELISPOT 분석은 저렴하고 CBA, 공인 회계사 및 ICS 분석 기술 (34)보다 수행 할 수 간단하다. SFC의 자동화 된 수동 카운팅 계수의 대안이고, ELISPOT 플레이트 전 또는 스폿 (C) 후, 최소 품질 손실과 오랜 기간 동안 실온에서 저장 될 수있다37 ounting.

장기 배양 ELISPOT IFN-γ 반응은 결핵 백신 반응을 평가할 때, 인간에 의한 메모리 응답 및 가축을 평가하기 위해 적용된 14-16,31-32,33. . TCM 응답도 같은 가축의 여러 가지 다른 감염원에 호스트 반응에서 중요한 역할을하는 것으로 가정한다 : 마이코 플라즈마 mycoides subsp mycoides (42), Anaplasma (38)과 소 호흡기 세포 융합 바이러스 (39) marginale은. 잠재적 장기 ELISPOT 분석은 다른 동물 종, 사이토 카인 및 감염에 대해 적응 될 수도있다. 이러한 폭 넓은 응용 프로그램으로 인해 특정 시약의 현재 제한된 가용성 수의학 면역학 애플리케이션에 특히 유용 할 것이다.

TCM 응답은 여러 감염에 대한 보호를 위해 매우 중요하다,하지만 엄마 (질병의 결과 예측 또는 백신 효능) 감염 / 예방 접종 후 초기을 측정Y는 복잡합니다. 생체 짧은 항원 자극 조건에서 면역 반응의 분석은 더욱 자주 특히 면역 학적 기억 형성의 시작시에 의한 메모리 및 이펙터 응답 중첩에, 이펙터 반응을 나타낼 것이다. 항원 부하가 연속 인 만성 질환의 맥락에서, 생체 반응은 이펙터 세포 반응 또는 메모리와 이펙터 세포 반응의 조합을 평가한다. 장기 배양 IFN-γ ELISPOT 분석은, 가능성 TCM 반응보다는 이펙터 T 세포 또는 결합 된 CD4 + T 세포 반응의 측정을 가능하게, 여기서 설명. 요약하면, 장기 배양 IFN-γ ELISPOT 분석은 T 세포 메모리 응답을 추정하기위한 유용한 방법을 제공하고 감염 제의 다양한 여러 종류의 메모리 응답을 평가하는 데 성공적으로 사용되어왔다 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

3625-32000-104 농업 및 식품 연구 이니셔티브 경쟁 그랜트 번호 : 연구 USDA, ARS 크리스에 의해 지원되었다. 식량 농업의 농무부 국립 연구소에서 2011-67015-30736. 우리는 제시카 폴락, 엠마 Frimml – 모건, 셸리 짐머만, 크리스틴베이스, 브루스 PESCH, 몰리 Stafne, 알렌 젠슨, 트레이시 포터 우수한 기술 지원뿐만 아니라 레베카 매디슨, 더그 유잉, 케이티 Pille, 제이 스테 펜, 데이비드 루버스 감사합니다 동물의 우수한 관리 및 처리를위한 로빈 Zeisness, 다윗 Panthen.

Materials

Sodium citrate (dihydrate) Various
Citric acid (monohydrate) Various
Dextrose Various
ELISPOT PVDF plate Various
Vectastain ABC – AP KIT Standard Vector Laboratories AK-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit Vector Laboratories SK-5300
Ag85A Lionex LRP-0004.3 23, 24, 25, 37
TB 10.4 Lionex LRP-0061.6 23, 24, 25, 37
PPDb Prionics AG 7600055
rESAT-6:CFP10 Kind gift Dr. Minion, Iastate 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 Serotec MCA1783B 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 Serotec MCA2112 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 Serotec MCA1653GA
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A Serotec MCA2434GA
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 Abcam ab95665
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 Serotec MCA1783PE
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 Invitrogen A-21130
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 SouthernBiotechnology 1080-193
Goat anti-rat IgG-APC Invitrogen A10540
BD Cytofix/Cytoperm™ BD Biosciences 554714
BrefeldinA Sigma-Aldrich B7651
Pokeweed Mitogen Sigma-Aldrich L8777
Recombinat human Interleukin 2 Sigma-Aldrich I7908
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Maggioli, M. F., Palmer, M. V., Vordermeier, H. M., Whelan, A. O., Fosse, J. M., Nonnecke, B. J., Waters, W. R. Application of Long-term cultured Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle. J. Vis. Exp. (101), e52833, doi:10.3791/52833 (2015).
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