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Abstract
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Neurociencias

Microchambres agarose à long terme de l'imagerie calcique<em> Caenorhabditis elegans</em

Published: June 24, 2015
doi:
10.3791/52742
, ,
1Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

Summary

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Abstract

Le comportement est contrôlé par le système nerveux. Imagerie calcique est une méthode simple chez le nématode Caenorhabditis elegans transparent pour mesurer l'activité des neurones au cours de divers comportements. Pour corréler l'activité neuronale avec le comportement, l'animal ne doit pas être immobilisé, mais devrait être en mesure de se déplacer. Beaucoup de changements de comportement se produisent pendant de longues échelles de temps et nécessitent l'enregistrement au cours de nombreuses heures de comportement. Cela rend également nécessaire à la culture des vers à la présence de nourriture. Comment les vers peuvent être cultivées et leur activité neuronale imagée sur des échelles de temps longues? Agarose Microchambre Imaging (AMI) a déjà été développé à la culture et observer les petites larves et a été adapté pour étudier toutes les étapes de la vie du début L1 jusqu'au stade adulte de C. elegans. AMI peut être effectuée sur divers stades de vie de C. elegans. Imagerie calcique à long terme est obtenue sans immobiliser les animaux en utilisant des expositions à court extérieur déclenchées comcombinée avec une multiplication d'électrons de dispositif d'enregistrement (EMCCD) caméra à couplage de charge. Zoom arrière ou la numérisation peut évoluer jusqu'à cette méthode à l'image jusqu'à 40 vers en parallèle. Ainsi, un procédé est décrit pour le comportement de l'image et l'activité neuronale sur des échelles de temps longues dans toutes les étapes de la vie de C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments.

Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or Förster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24.

When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip.

Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

Protocol

1. Instruments, Culture Media, et Plats Utilisation d'un microscope qui est capable de maintenir l'échantillon au point et qui est équipé d'une étape automatique. Construire un couvercle chauffe-mesure ou acheter une solution commerciale. Mettre en place un EMCCD LED-système de caméra dans lequel l'exposition de la caméra déclenche l'éclairage LED à travers un signal TTL en utilisant les instructions du fabricant. Remarque: Voir la discussion pour plus de détails. Polydimethylsiloxane (PDMS) timbres: Fabriquer PDMS timbres dans un centre de la microfluidique ou PDMS ont les timbres produits par une fonderie commerciale. Pour utiliser une fonderie commerciale, envoyer un fichier autocad à la société et spécifier la profondeur (15 um, par exemple) de l'appareil. Après la livraison de la fonderie, couper la puce PDMS dans ses 16 timbres au moyen d'un scalpel. Lier chaque timbre individu à une lame de verre en utilisant du plasma de l'air. Pour le collage, exposer à la fois le timbre de PDMS et la lame de verre à plasma d'air pour uncombat 1 min (en utilisant les paramètres les plus élevés de plasma à 0,5 mbar). Veiller à ce que les surfaces de collage sont confrontés à la hausse au cours du traitement par plasma. Ensuite, placez le timbre PDMS sur la lame de verre. Prenez un plat en bas de 3,5 cm et découpez un carré de 18 x 18 mm à partir du centre du fond du plat à l'aide d'une fraiseuse verticale et couteaux rotatifs tranchants. Utiliser une faible vitesse de rotation du dispositif de coupe et d'alimentation lente pour empêcher la matière plastique de la fonte en raison de la chaleur produite par le frottement. Préparer plusieurs plats à la fois. Remarque: Le fond plat peut être réutilisé plusieurs fois après l'expérience si elle est nettoyée après trempage dans de l'éthanol pur O / N. Agarose: Dissoudre 3 g de point de fusion élevé agarose dans 100 ml S-basale (5,85 g NaCl, 1 g de K 2 HPO 4, 6 g de KH 2 PO 4, 1 ml cholestérol (5 mg / ml dans de l'éthanol), H 2 O à 1 L, stériliser à l'autoclave) par ébullition. Assurez aliquotes du agarose dissout dans 2 ml tubes Eppendorf et store. En outre, de préparer un lot de bas point de fusion agarose exactement de la même manière que le point de fusion élevé agarose. Avant utilisation, placer 3 aliquotes de point de fusion élevé agarose sur un bloc de chauffage à 95-98 ° C. Avant utilisation, placer une aliquote de bas point de fusion agarose sur un bloc de chauffage à 95-98 ° C jusqu'à ce qu'il soit fondu, puis sur un bloc de chauffage à 30 – 35 ° C. 2. Sélection des animaux Cultivez les vers à une faible densité sur des plaques NGM ensemencées pour obtenir des animaux propres. Assurez-vous que il ya beaucoup de nourriture et seuls quelques animaux sur la plaque. Pour l'imagerie larves L1, transférer environ 30 oeufs contenant des embryons au stade de bretzel sur une nouvelle plaque ensemencée NGM. Pour transférer les stades larvaires plus tard ou adultes C. elegans, transférer environ 30 vers sur une nouvelle plaque ensemencée NGM. 3. Préparation de Agarose microchambres Préparation du plat: Prenez un plat en plastique avec une ouverture carrée de 18 x 18 mm à la base et placez-le à l'envers avec l'ouverture vers le haut. Fermez l'ouverture en plaçant un morceau de ruban adhésif double-face collante de 20 x 20 mm sur l'ouverture. Mettez le plat autour de sorte que le ruban adhésif est sur le fond et placer le plat sur une surface dure. Couper l'ouverture libre à l'aide d'un scalpel. Avec une pipette P1000, remplissez 2 ml de 3% point de fusion élevé agarose dans S-Basal dans le plat. Placez le agarose sur la zone qui entoure l'ouverture et laisser solidifier. Attendez jusqu'à ce que l'agarose est solide. Tourner autour du plat et de décoller le film de protection qui recouvre l'adhésif double-face collante de sorte que le côté collant restera sur le plat et sera exposée. Remarque: Par conséquent, un anneau amende de ruban adhésif va entourer l'extérieur de l'ouverture. L'agarose sert de réservoir d'humidité qui seront ensuite entourer l'échantillon. Fonderie de microchambres: Exposer ee surface de PDMS pour le moulage avec un plasma d'air pour 20 à 60 sec. Remarque: Ce traitement par plasma rend les PDMS surface hydrophile, ce qui empêche le piégeage de bulles d'air et produit des impressions nettes. Construire deux entretoises de hauteur égale par l'empilement de 5-9 des lames de verre. Place, en parallèle à leurs côtés longs, la première entretoise pile, puis une lame de verre unique, puis de nouveau une entretoise pile. Passer la lame de verre qui contient le tampon PDMS orthogonalement à travers les pièces d'écartement. Ajuster la hauteur des entretoises de sorte qu'il existe un espace d'environ 1,5 mm entre la surface de moulage du poinçon PDMS et la lame de verre unique. Déposer une goutte de liquide chaud-point de fusion élevé agarose sur la lame de verre unique près du timbre en PDMS et rapidement glisser les PDMS timbre verticalement dans l'agarose liquide. Laissez le agarose solidifier. Vérifiez que cela devient un aspect opaque, qui prend habituellement environ 2 min. Retirez le timbre verticalement avec un mouvement. Remarque: Il est commode à GLue l'entretoise glisse avec du ruban double-face collante. Le mouvement vertical du tampon empêche les bulles d'air de se trouver piégé dans l'agarose. Transférer les œufs ou les vers avec des bactéries OP50 sur le agarose en utilisant une amende choix de fil de platine. Distribuez un oeuf ou un ver par chambre avec de la nourriture à l'aide d'un cil. Remplissez environ 30 oeufs sur un plot agarose. Couper la dalle agarose contenant les microchambres remplis dans un carré d'environ 15 x 15 mm afin qu'il tienne bien dans l'ouverture de la coupelle. Ramassez la dalle agarose carré avec une pince et placez-le à l'envers sur une lamelle de verre de 20 x 20 mm. Une fois tombé, ne pas soulever à nouveau ou faites-le glisser autour parce que cela peut causer des bactéries et des vers de terre pour être poussés hors de leurs chambres. Assemblée de l'antenne: Placer la lamelle de verre sur l'ouverture de la coupelle en plastique. Appuyez doucement la lamelle de verre sur la bague faite de ruban adhésif double-face collante.Prenez soin de ne pas briser le verre. Mettez le plat à l'envers et utiliser une pipette P1000 pour combler l'écart entre la dalle agar contenant les microchambres et le réservoir de liquide agarose à bas point de fusion agarose refroidi à environ 30 ° C. Attendez jusqu'à ce que l'agarose est solidifié. Sceller le plat avec un couvercle. Pour microscopes inversés utiliser un couvercle chauffant. Pour les microscopes droits utiliser un couvercle normal et sceller le plat avec du Parafilm. Après avoir terminé la préparation de microchambres, vérifiez-les sous un stéréomicroscope. L'exactitude de remplissage est crucial. Voir la discussion pour plus de détails. 4. Imagerie de calcium Utilisez souches transgéniques exprimant capteurs de calcium génétiquement codés tels que HBR16 (goeIs5 [rmnp-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3'UTR, unc-119 (+)]) 27. Utilisez un microscope composé équipée pour grand champ épifluorescence. Connectez la sortie TTL de la caméra EMCCD àl'entrée TTL de la LED, de sorte que chaque fois que la caméra enregistre une image de l'échantillon est éclairé. Utilisez un temps d'exposition d'environ 5 ms. Utilisez le gain EM dans la gamme de 50 – 300. Spécifiez un film d'éclatement fonctionnement pendant 24 heures à chaque ver imagé tous les 15 – 30 min abord pendant 20 secondes avec DIC, puis pendant 20 secondes avec une fluorescence de la GFP pour enregistrer GCaMP, et ensuite prendre une image finale du signal mKate2 est pris pour le contrôle des niveaux d'expression. Utilisez un taux de 2 / sec de cadre lors de chaque salve. Pour l'inspection visuelle de données, utilisez une carte en fausses couleurs pour améliorer la visibilité de petites variations de l'intensité de fluorescence. Terrain données fluorescentes que AF / F, avec F étant la valeur de base moyenne de fluorescence. Une description détaillée de l'analyse des données de calcium peuvent être trouvées dans la littérature 20. 5. parallèle AMI de Worms multiples Placer le plat contenant les microchambres sur le microscope, se concentrer sur l'échantillon et engager le autofocus. Mettre en place un protocole de logiciel de sorte que la caméra prend une rafale de 40 trames d'image en 20 sec chaque demi-heure pendant 24 heures, ce qui se traduira par 1.920 images par vis sans fin, une quantité raisonnable de données. Mettre en place la numérisation de sorte qu'il visite chaque ver utilisant la scène. Viser à filmer environ 30 vers en un seul passage. Image de multiples vers de zoom arrière, soit en utilisant un faible grossissement. Utilisez un faible grossissement pour couvrir plusieurs microchambres avec la puce de la caméra et de filmer plusieurs microchambres adjacentes simultanément. Après la fin de l'acquisition d'image, séparer les données pour chaque chambre individuelle par découpe d'une région d'intérêt portant sur un animal. Pour évaluer rapidement les données de mobilité, utiliser de soustraction 28-32. 6. imagerie différentes étapes de la vie de C. elegans Utilisez microchambres agarose pour toutes les étapes de la vie de C. elegans de L1 à l'âge adulte et dont dauers. Utilisez les dimensions de la chambre appropriées pour différentes étapes de la vie qui apparaissent dans le tableau 1. l'étape de vie taille de la Chambre Profondeur de champ Durée d'enregistrement typique Grossissement L1 190 x 190 um 10 – 15 um oeuf – mi L2 400X L2 370 x 370 um 15 pm oeuf – L3 200X Dauer larve 370 x 370 um 25 um 4 jours 200X L3 700 x 700 um 45 um L2 – L4 200X L4 700 x 700 um 45 um L4 jeune – jeune adulte 100X Jeune adulte 700 x 700 um 45 um </td> 12 – 24 h 100X Tableau 1. tailles Chambre pour les différentes étapes de la vie. Montré sont dimensions de la chambre et de grossissements qui sont utiles pour diverses étapes optimisés pour une puce de caméra 8 x 8 mm.

Representative Results

Microchambres agarose peuvent être appliquées à toute étape de la vie de C. elegans. Comme on peut le voir sur la figure 1A, le développement des larves et le comportement au cours du sommeil L1 lethargus peuvent être observées. Affichés sont des tailles de chambre qui sont 190 x 190 um, 10 um de profondeur. Si des échelles de temps plus longues sont nécessaires, les grandes chambres peuvent être utilisés. Comme on peut le voir sur la figure 1B, en utilisant une chambre avec des dimensions plus grandes (370 x 370 um, 25 um de profondeur) permet le développement de C. elegans de l'oeuf jusqu'à l'adulte. Figure 1C montre une analyse des changements à long terme dans le comportement en utilisant le principe de soustraction d'un ver grandi dans une chambre de l'oeuf jusqu'à l'adulte. Montré sont des intensités moyennes après soustraction d'une image pour rafales sélectionnés pendant sillage et lethargus. La baisse de l'intensité moyenne après les valeurs cadre de soustraction est élevé, plus la mobilité du ver. Montré sont choisis traces d'éclatement d'un état d'éveil et une condition de lethargus par stade larvaire. Leaugmentation observée en intensité moyenne au cours du développement est principalement due à l'augmentation de contraste et la taille de l'animal. Figure 1D montre une larve dauer, un stade de remplacement de la vie qui est engagée dans des conditions environnementales défavorables 33. taille de la chambre est de 370 x 370 um, 15 um de profondeur. Notez que la larve de dauer a été placée dans la chambre sans nourriture bactérienne, ce qui provoquerait la sortie du stade larvaire dauer. Figure 1E montre un ver adulte qui a déjà mis beaucoup d'oeufs dans la chambre. Dimensions de la chambre utilisée pour l'adulte étaient 700 x 700 um, 45 um de profondeur. Enfin, la figure 1F montre un hermaphrodite adulte et un accouplement mâle à l'intérieur d'une chambre d'adulte. Imagerie calcique dans les vers mobiles est possible avec des capteurs de calcium GCaMP. Figures 2A, B montrent imagerie calcique de la commande interneurone AVA pour une larve L1 27. Les figures 2C, D montrent une activité de calcium pour la SAme type de neurone dans un animal adulte. Mettre en place l'imagerie à long terme est possible par la numérisation et en zoomant sur. Figure 3A montre la qualité d'image de l'imagerie simultanée de 30 vers sur une puce de la caméra avec un appareil photo de 5 mégapixels. La figure 3B montre la qualité de 4 vers calcium imagée simultanément d'image. Figure 1. Adaptation de l'AMI à tous les stades de la vie de C. elegans. (A) Larve imagée à partir de début L1 jusqu'à ce stade précoce L2 en 190 x 190 um chambres. (B) le développement de l'oeuf jusqu'à l'adulte dans une chambre 370 x 370 um. (C) La mobilité d'un ver évaluée à l'aide de soustraction. Montré est l'intensité moyenne de toutes les images de l'image après soustraction d'une image pour un film en rafale sélectionnée pour chaque sta larvairege sillage et le comportement lethargus. (D) Une larve de dauer en l'absence d'alimentation dans une chambre de 370 x 370 um. Hermaphrodite (E) des adultes avec de nombreux œufs pondus dans une chambre de 700 x 700 um. (F) d'accouplement d'un mâle et d'une hermaphrodite intérieur d'une chambre de 700 x 700 pm. YA signifie jeune adulte. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. imagerie de calcium avec AMI. (A) d'imagerie de calcium avec GCaMP3 dans la commande interneurone AVA des larves L1 en utilisant le promoteur RMN-1. Montré sont deux images en fausses couleurs. Dans l'image de gauche, l'activité de AVA est faible et le ver ne fait pas un mouvement vers l'arrière. Dans l'image de droite l'activité de AVA est haute, et le ver se déplace vers l'arrière. transitoires (B) de calcium dans le temps pour un ver L1. (C, D) transitoires de calcium dans un animal adulte. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. imagerie multiples vers en parallèle par un zoom arrière. (A) de l'imagerie simultanée de 30 L1 vers par trame utilisant 190 x 190 um chambres et un grossissement 100X (en utilisant un objectif 10X) et une puce de caméra 16,6 x 14 mm. (B) de l'imagerie simultanée de quatre vers L3 par image à l'aide de 370 x 370 um chambres et 100X et une région d'intérêt d'une puce de caméra 16,6 x 14 mm.et = "_ blank"> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Matériel

L'objectif d'un microscope sera généralement la dérive lors de l'acquisition d'image à long terme. Pour microscopes composés, se concentrer maintien systèmes peuvent être achetés auprès des principaux fabricants de microscopes. Dans le cas d'un microscope composé avec commande de mise au point est trop cher, une alternative simple serait d'utiliser une loupe binoculaire. Microscopes composés permettent l'utilisation d'objectifs avec une ouverture numérique élevée (NA) et peuvent être facilement automatisés. Objectifs de pétrole 40X sont bien adaptés. lentilles d'immersion de l'eau ne sont pas idéal en raison de l'évaporation lors de l'imagerie à long terme. Contraste interférentiel différentiel (DIC) génère un joli contraste qui permet de suivre les changements morphologiques et comportementales, mais simple, l'imagerie du champ lumineux peut également être utilisé. Pour DIC ou l'imagerie en champ clair, utiliser la lumière rouge en plaçant un filtre de lumière rouge dans le chemin dia-éclairage du microscope. Pour la numérisation de plusieurs microchambres une étape automatisée est nécessaire. Meilleure performance est achieved quand une étape est utilisé qui a accélération et de décélération non linéaire et peut être programmé à basse vitesse de balayage pour éviter de perturber les animaux lors de la numérisation. Nous avons pas observé les réactions comportementales ou augmentation de calcium dans les neurones mécanosensibles (ALM et PLM) pendant le balayage, ce qui suggère en effet que la numérisation lente ne pas activer le système mécanosensible du ver (données non présentées). Systèmes à DEL commerciaux peuvent être utilisés. Plusieurs compagnies offrent des solutions prêtes à l'emploi qui incluent les diodes à différentes longueurs d'onde. La LED devrait avoir la possibilité de déclencher l'extérieur de la LED avec un signal TTL. Une caméra très sensible est nécessaire pour l'imagerie de calcium des animaux en mouvement. caméras EMCCD sont les caméras les plus sensibles sur le marché. La caméra doit avoir une sortie TTL lors de l'exposition (aussi appelé de sortie "de feu"). Dispositif de chauffage du couvercle est nécessaire pour éviter la condensation sur le couvercle si l'on utilise un microscope inversé. Sur un microscope droit, le plat sera placé de telle sorte que le couvercle wiserai en bas et ainsi on empêche la condensation et pas de chauffage du couvercle est nécessaire. Le couvercle doit fermer hermétiquement le plat pour éviter l'évaporation de l'eau lors de l'imagerie à long terme.

PDMS timbres

La surface du tampon de PDMS contenant la structure pour le moulage de l'agarose est confronté à une distance de la lame de verre, qui supporte le timbre PDMS. Une liste des entreprises qui offrent des puces microfluidiques personnalisé peut être trouvée sur Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).

Combler les nématodes dans leurs chambres

Ceci est l'étape la plus critique dans le protocole et les points suivants doivent être pris en considération: A) La moiteur de l'agarose est crucial pour transférer les vers et pour l'imagerie. Si l'agarose est trop humide, à savoir, il est un liquide coveRing une superficie de plusieurs microchambres, il ne sera pas possible de distribuer de la nourriture et les vers bactérienne d'une manière contrôlée parce que le liquide rendra les bactéries écoulent. Si l'agarose est trop sec puis les bactéries et les vers ne peuvent pas descendre le pick facilement, ce qui signifie que plus de force doit être utilisée pour déposer les vers et les bactéries qui provoque facilement des dommages à l'agarose. Lors du remplissage dans un grand nombre de vers l'agarose peut tarir. Dans le pire des cas, l'agarose sera tellement sec à la fin ce que les chambres seront effondrer. Si l'agarose est trop sec, il peut être réhydraté en plaçant une petite goutte (environ 2 pi) de S-basale sur le côté de la puce où il n'y a pas de vers. Puis tremper le fil de platine ramasser dans le liquide et même tirer une partie du liquide dans la zone où les chambres sont remplies avec des vers. B) La quantité de nourriture est essentiel pour le succès de l'imagerie à long terme. Si il n'y a pas assez de nourriture, les vers peuvent courir hors de lui. En cas de nourriture excessive de la cavité de la chambrene sera pas se comporter comme un liquide, mais plutôt comme un solide et permettra des vers d'échapper à la chambre en poussant les bactéries. Viser à obtenir une suspension bactérienne qui remplit toute la chambre. Les vers sont en contact physique constant avec la surface de la gélose et le verre le long de la plupart de leur longueur pendant l'expérience et le comportement ramper semble similaire au mouvement sur une plaque et différente de rosser en liquide. C) mécanique dommageable de l'agarose peut ruiner l'expérience. Une amende choix est essentiel. Il ne doit pas avoir des coins pointus. Un cils douce attaché à une pointe de pipette peut être utilisé pour déplacer des bactéries ou des vers dans les chambres au lieu d'utiliser un pick de platine. Dans la plupart des cas, cependant, l'agarose surséchée est la raison de dommages. Le pic ou cils devraient, idéalement, à peine toucher le agarose lui-même, et le film d'eau sur la surface d'agarose devrait retirer les vers et les bactéries. Quand les chambres d'étanchéité, de plus, l'humidité de l'agarose est essentielle. Il ne devrait pasêtre tout liquide libre sur la surface de la gélose parce que cela peut laver les bactéries et les vers pendant le scellement. Grosses bulles peuvent être enlevés en soulevant doucement un coin de la dalle agar. De petites bulles plus petites que la chambre souvent piégés à l'intérieur des chambres. Ces bulles ne sont pas un problème et vont disparaître par absorption. Après le montage de l'antenne, vérifier à nouveau que l'agarose est pas trop sec ou trop humide. Les chambres doivent être bien fermés et il ne devrait pas y avoir de flux de liquide entre les chambres. Si l'agarose est trop humide, les chambres ne sont pas étanches. Worms peuvent échapper ou leur nourriture seront emportés. Si l'échantillon est trop humide, simple d'ouvrir le couvercle et laisser sécher agarose pendant une minute ou deux. Si l'agarose est trop sec, les chambres peuvent effondrer et les vers vont échapper.

Mise à l'échelle par un zoom arrière

Pour l'imagerie de fluorescence, un zoom arrière est limitée par la faible quantité de lumière obtenue à faible grossissement. En outre, EMCCD caméras sont optimisé pour une sensibilité et ont souvent une résolution relativement faible. Toutefois, la mise à l'imagerie quatre fois est bien possible. Par exemple, quatre chambres de 190 um x 190 um peuvent tenir sur une image lors de l'utilisation 140X grossissement (réalisé en utilisant un 20X Objectif et une caméra 0.7X montage) et un pixel de 512 x 512, 8 x 8 mm caméra. Une caméra haute résolution avec une grande puce (comme sCMOS caméras, 16,6 mm x puce de 14 mm, 2560 x 2560 pixels = 5.5 mégapixels) optimise l'intensification des DIC et l'imagerie en champ clair. Par exemple, jusqu'à 30 vers L1 à 190 um x 190 um chambres peuvent tenir sur chaque image de cette caméra en utilisant un grossissement 100x (voir Figure 3). En principe, un zoom arrière et la numérisation peut également être combinés pour obtenir encore plus de numéros d'animaux. La plupart des neurones restent tout à fait bien au point, de sorte qu'un seul plan focal doit être imagée. Si les neurones se trouvent à sortir de la mise au point, az numérisation à l'aide d'un lecteur de piézo peut être prise à chaque fois point.

Adaptation aux différents comportements

Ce protocole donne une bonne idée du comportement à travers des échelles de temps longues. Il est évident que la synchronisation des salves doit être adaptée à différents comportements et stades de la vie.

Limites de la technique

Plusieurs facteurs limitent la durée de l'imagerie. Le plus important est la quantité de nourriture. Une fois que la nourriture est consommée, les larves cessé de se développer. Ainsi, dans de petites chambres (190 x 190 um) vers se développent jusqu'au stade L3, puis arrêter. Si une durée de temps de formation d'image est nécessaire, de plus grandes chambres doivent être utilisés. La durée maximale de l'imagerie à long terme est de l'ordre de 2,5 à 3 jours. Si plus imagerie est nécessaire, les vers doivent être récupérés et placés dans de nouvelles chambres. Lorsque imagerie vers adultes, une autre limitation est causée par la progéniture de ces vers. Les vers adultes pondent des œufs à partir de laquelle les larves éclosent. Ces larves sera également rester à l'intérieur de la chambre, Consommer de la nourriture, et peuvent perturber l'analyse d'image. Si la progéniture est un problème, une solution est d'utiliser soit les adultes stériles ou de placer plusieurs reprises les vers dans les chambres fraîches. Pour récupérer les vers, la dalle agarose contenant la chambre est coupée gratuit avec un scalpel, on arrache la lamelle, et est placé sur une plaque NGM à partir de laquelle les vers peuvent être récupérés. Une autre limite est la restriction des vers à des zones relativement petites. Cela peut être un problème si le mouvement à long terme doit être analysé. Alors que les animaux dans les chambres peuvent être stimulées mécaniquement et optogenetically 21,27,34,35, la nature fermée de la chambre, il sera difficile d'appliquer stimulants solubles ou volatiles. Gaz biologiquement importants tels que l'oxygène ou le dioxyde de carbone peuvent se diffuser librement dans la gélose. Le grand réservoir d'air dans le plat devrait maintenir les concentrations de gaz dans les chambres constants sur le temps nécessaire pour les expériences. Cependant, il faut garder à l'esprit que la Concentratio locale d'oxygènen dans la chambre peut ressembler de plus les conditions trouvées dans une culture liquide de la culture sur la plaque.

Importance par rapport aux méthodes existantes

Les dispositifs microfluidiques ont grandement avancé comportement et du développement étudié en C. elegans. Souvent, les structures microfluidiques sont faites de PDMS 12. Ici, nous décrivons un protocole pour générer des chambres de culture microfluidiques fabriqués à partir d'agarose. La force de cette technique est la combinaison de haute qualité d'imagerie, la corrélation du comportement avec des mesures physiologiques, imagerie à long terme, et un assez haut débit. Haute qualité d'image est obtenue par l'imagerie à travers la lamelle de verre en utilisant des objectifs à grande ouverture numérique. Par conséquent, l'imagerie par fluorescence tel que l'imagerie de calcium et l'imagerie confocale de structures sous-cellulaires peut être effectuée. Parce que les animaux ne sont pas immobilisés comme dans d'autres systèmes, il permet une corrélation avec le comportement des mesures physiologiques. Because les animaux ont suffisamment de nourriture, ils continuent à développer l'imagerie permettant à long terme. Ce système peut l'image de beaucoup de vers en une seule opération parce que les animaux sont limités à leurs chambres définies. Ainsi, ce procédé peut être facilement mis à l'échelle en place 9,27,34-36.

Les applications futures

Jusqu'à présent, ce système a été utilisé principalement pour étudier le comportement de sommeil en C. elegans larves L1. Cependant, l'adaptation à toutes les étapes, il sera possible d'étudier un large éventail de comportements aussi dans dauers et les adultes. Un large éventail de comportements peut être étudiée avec cette technique allant de l'accouplement à la ponte.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La Société Max Planck et une allocation Junior Groupe Göttingen Graduate School à HB a financé ce travail.

Materials

high-melting point agarose Fisher Bioreagents BP(E)164-1000
Top Vision Low Melting Point Agarose Thermo Scientific R0801
LED system CoolLED pE-2
compound microscope Nikon TiE
stereomicroscope Leica M5
EMCCD camera Andor iXon 897 now sold as iXon Ultra 897
sCMOS camera Andor Neo
plasma cleaner Harrick PDC-23G2
lid heater MPI workshop custom made
plastic dish Falcon 08-757-100A
z-stage for the microscope Prior Nano Scan Z
x-y-stage for the microscope Prior Proscan III
PDMS stamp Abbott Laboratories  custom made
red light filter Chroma ET660/50m
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Referencias

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Turek, M., Besseling, J., Bringmann, H. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (100), e52742, doi:10.3791/52742 (2015).
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