的测定血细胞种群<em>果蝇</em>幼虫

1，血细胞出血/刮分析准备幻灯片： 选项​​1的显微镜没有瓦片扫描功能：对于每一个幼虫要分析，制备一种玻璃载玻片用各2毫米的正方形约5巴氏笔井，对应于显微镜的领域观察区域;添加约5 – 10微升S2媒体的每个（图1A）。保持滑动保湿室，以防止井干燥。 选项​​2为显微镜用瓷砖扫描功能：对于每一个幼虫待分析，准备为〜3 3至4巴氏笔井1载玻片 – 每4平方毫米;加约15 – 20微升S2介质到每个孔中（图1B）。保持滑动保湿室，以防止井干燥。 注：孔的上述建议的数量是足够的每幼虫总数高达3000血细胞（后第二龄幼虫，〜2.5 – 3毫米的长度，转基因标签的大部分larv的人血细胞）。当评估较大血细胞数目，更多的井可能需要避免过度拥挤。 收集幼虫： 喷射水成含有幼虫和冲洗幼虫到培养皿蝇小瓶，或舀一些食品包含幼虫到培养皿，并用喷瓶，用水稀释。 轻轻一挑出来的幼虫用画笔培养皿中，并放置在水中一腔的菜，或在冷块上的幻灯片。 注：幼虫可以保持在水或冷块上的有限的时间;使用在45分以下的标本，以免幼虫死亡或血细胞有害的影响。 解剖： 冷金属块在荧光显微镜下选择幼虫。如果需要测量尺寸和图像幼虫。 隔离循环血细胞（“渗透”）的： 一旦幼虫被选择时，将一只幼虫在第一巴氏笔井（图1C，2A）。 使用2清洁针具或解剖剪刀和镊子，使切口同时在后部和前幼虫的末端。为了避免干扰居民的血细胞，最好是在幼虫腹侧使这些切口。对于一致的结果，使每一个幼虫相同位置的切口。为1日龄幼虫，1切口（在腹侧前）就足够了。 允许幼虫流血了几秒钟，没有任何压力或身体搅拌（ 图2A）。 注：如果处理多个幼虫，最好在进行下一步骤，以避免保持幼虫在冰上太长可能影响样品“完整性之前，使这些切口为每一个。 轻轻抬起用针或镊子幼虫蘸到第二口井，以冲洗任何剩余的循环血细胞。在此之后，按照与居民血细胞释放。 <l我>居民血细胞分离（“刮”）： 幼虫轻轻转移到下一个孔（图2C）。 识别幼虫，其典型地位于约1/3从幼虫的前端的淋巴腺，并且其可以通过幼虫体壁背侧荧光。避免淋巴腺，同时通过牵制的幼虫用针尽可能接近到淋巴腺，以避免刺穿（ 图2C），释放居民的血细胞。 注：在正常发展的淋巴腺血细胞的成熟相比，幼虫的血细胞被延迟，并有区别的血细胞的荧光记者可能不会显示在低龄幼虫的淋巴腺的信号。在这些情况下，关注较少需要由淋巴腺血细胞支付给淋巴腺因为没有污染分化荧光标记的幼虫血细胞的预期。 在dissecti释放居民的血细胞拼抢和/或猛刺的过程。使用一个针尖根据需要有效地牵制附近的淋巴腺幼虫（见上文）或其他身体部位。使用其他针戳在血细胞可见的通过幼虫体壁（ 图2C，E）的集群，目标是分开的血细胞。血细胞也可以被释放在一个刮运动。然而，早期的撕裂表皮可能释放出的血细胞，这可能使自动计数更具挑战性的大型集群。 注意：根据幼虫的年龄和基因型，总血细胞的数量将有所不同。分发上述过几口井，以避免一些井血细胞，这可能使单细胞图像分析的难度拥挤的释放过程。 如果几个血细胞留在最后胴体，算上这些血细胞通过观察通过手动式计数器（ 图2E）的显微镜和使用。为了方便计算，P花边胎体上相同幻灯片的洁净区和传播它尽可能地薄，以减少光学面的数目。 一旦解剖完成后，等待之间5 – 10分钟使细胞成像孔之前沉淀（但不一定附着）。孵育幻灯片的保湿室，以避免干燥，避免野蛮装卸的幻灯片，这可能会扰乱安定血细胞。 注：当确定血细胞数量，释放的细胞是不固定的，细胞必须被成像解剖后不久，优选在从幼虫释放后30分钟。 10分钟，这应该通过聚焦通过在阱的介质的光学平面的确认 – 视的介质和电池特性在卷上，将细胞中的绝大多数将已在5结算。但是，血细胞只有一小部分将已经粘附至所述滑动表面通过这个时候，也需要考虑的事实，如果修改这一协议，进行细胞固定基approache秒。 定量： 就拿落户血细胞图像的荧光显微镜（ 图2B，D，F）下。按照与使用ImageJ软件血细胞的定量。 准备图像ImageJ的细胞计数算法： 采用国内的ImageJ打开图像：文件→打开→（找到文件，并选择）。 确保图像（S）是8位或16位。调整阈值的图像通过选择图片 ，然后单击调整 ，然后选择阈值 。遵守“ 阈值窗口 ”（ 图3A）。 检查“黑暗背景”选项。选择“红色”，并增加了低阀值 （见黑色箭头），直到图像中的每个细胞都标有一个红点（即不被覆盖将灰阶可以看到细胞; 图3B）。作为下限阈值增加某些细胞会变得无标记。这对于多远设置下限阈值指示器。 注：有时细胞簇不能得到解决，将被计为一个由粒子计数器。在这种情况下，细胞在一个簇的数目可以通过检查图像（如果需要放大），并使用式计数器人工计数来估计。或者，所述下限阈值可以提高到解决细胞簇;从该操作产生的任何未标记的细胞然后可以使用一式计数器计数。 使用ImageJ分析细胞数： 发射粒子分析仪计数细胞 （图3C）。选择分析 ，然后单击分析粒子。（可选）选择“叠加纲要 ”中看到的粒子计数算法（图3D）。可替代地，设置限制向一个单元的大小或像素的区域（ 例如。，细胞， 细胞等）的算法的丛计数。 单击确定。观察与计数（ 图3E）的摘要窗口。 2.血细胞干扰试验打扰血细胞，选择幼虫，并将其放置在一个2 ml离心管约为0.5克玻璃珠（212 – 600微米），并加入0.5毫升的水。 涡管，通过手，以速度10℃1分钟。 由溢出的微量离心管中的内容到培养皿并挑选出幼虫用画笔检索来自玻璃珠的幼虫。 为恢复阶段，放置在幼虫预先制备培养皿与少量飞食品。允许幼虫以重新建立它们的血球图案的一段45分钟或根据需要。 注：放弃已经停止运动，因为他们在这个过程中已经死亡的任何幼虫。然而，我们通常见升后ittle损害涡旋1分钟（见下文和补充图1）。 恢复期后，继续出血/刮含量，如第1如上所述。