Het gebruik van een hoge resolutie infrarood thermografie (HRIT) voor de studie van Ice Nucleatie en Ice Voortplanting in Planten
Summary
Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).
Abstract
Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.
Introduction
Vriestemperaturen die optreden wanneer planten actief groeien kan dodelijk zijn, vooral als de plant weinig of geen vriestolerantie. Dergelijke vorst gebeurtenissen hebben vaak verwoestende gevolgen voor de landbouwproductie en kan ook een belangrijke rol spelen in het vormgeven van de gemeenschap structuur in natuurlijke populaties van planten, vooral in de Alpen, sub-arctische en arctische ecosystemen 1-6. Episodes van ernstige vorst in het voorjaar hebben grote gevolgen voor de productie van fruit in de Verenigde Staten en Zuid-Amerika in de afgelopen jaren 7-9 gehad en zijn verergerd door de vroege begin van warm weer gevolgd door meer typische gemiddelde lage temperaturen. De vroege warme weer induceert knoppen te breken, het activeren van de groei van nieuwe scheuten, bladeren en bloemen die allemaal zeer weinig tot geen vorsttolerantie 1,3,10-12. Dergelijke grillige weerpatronen zijn gemeld aan een directe weerspiegeling van de gang zijnde klimaatverandering en zullen naar verwachting een gemeenschappelijk weerpatroon voor de fores zijneeable toekomst 13. De inspanningen om economisch, effectief en milieuvriendelijk beheer technieken of landbouwchemicaliën die verhoogde vorsttolerantie kunnen verschaffen hebben beperkt succes voor tal van redenen had, maar dit kan deels worden toegeschreven aan de complexe aard van de bevriezing tolerantie en bevriezing vermijden mechanismen in planten. 14
Het adaptieve mechanismen van vorst overleving in planten worden traditioneel onderverdeeld in twee categorieën, vorsttolerantie en invriezen te voorkomen. De eerste categorie wordt geassocieerd met biochemische mechanismen geregeld door een specifieke set van genen die het mogelijk planten om de spanningen in verband met de aanwezigheid en de dehydratieve effect van ijs in haar weefsels tolereren. Terwijl de laatste categorie is typisch, maar niet alleen, in verband met structurele aspecten van een plant dat als bepalen wanneer en waar ijsvormen in een plant 14. Ondanks de prevalentie van bevriezing voorkomen als adaptive mechanisme, is weinig onderzoek besteed in de afgelopen tijd tot het begrijpen van de onderliggende mechanismen en regulering van bevriezen te vermijden. De lezer wordt verwezen naar een recent overzicht 15 voor meer details worden gegeven.
Hoewel ijsvorming bij lage temperaturen lijkt een eenvoudig proces, vele factoren dragen bij aan het bepalen van de temperatuur waarbij ijs nucleates in plantenweefsels en hoe het zich binnen de plant. Parameters zoals de aanwezigheid van extrinsieke en intrinsieke ijskiemvormers, heterogene vs. homogene nucleatie gebeurtenissen, thermische-hysteresis (antivries) eiwitten, de aanwezigheid van specifieke suikers en andere osmolyten en een groot aantal structurele aspecten van de plant kan spelen een belangrijke rol in het vriesproces in planten. Tezamen zijn deze parameters beïnvloeden de temperatuur waarbij een plant bevriest, waarbij ijs ingeleid en hoe deze groeit. Ze kunnen ook invloed hebben op de morfologie van de resulterende ijskristallen.Verschillende werkwijzen zijn gebruikt om het vriesproces in planten te bestuderen onder laboratoriumomstandigheden, inclusief kernmagnetische resonantiespectroscopie (NMR) 16, magnetic resonance imaging (MRI) 17, cryo-microscopie 18-19 en lage temperatuur scanning elektronenmicroscopie (LTSEM ). 20 Het invriezen van hele planten in laboratorium en veldinstellingen is echter voornamelijk bewaakt met thermokoppels. Het gebruik van thermokoppels bevriezing studie is gebaseerd op het vrijkomen van warmte (smeltenthalpie) wanneer water een faseovergang van vloeibaar naar vast ondergaat. Het invriezen wordt vervolgens geregistreerd als een exotherme gebeurtenis. 21-23 Hoewel thermokoppels zijn de typische voorkeursmethode bij het bestuderen bevriezen in planten, het gebruik ervan heeft vele beperkingen die de hoeveelheid gegevens die tijdens de bevriezing gevallen beperkt. Bijvoorbeeld met thermokoppels moeilijk bijna onmogelijk om te bepalen waar het ijs wordt geopend planten, hoe het propageert,als het zich voortplant in een gelijkmatig tempo, en als sommige weefsels blijft ijsvrij.
Vooruitgang in een hoge resolutie infrarood thermografie (HRIT) 24-27, echter, zijn aanzienlijk toegenomen de mogelijkheid om informatie over de bevriezing proces in hele planten te verkrijgen, vooral bij gebruik in een differentiële imaging-modus. 28-33 In dit verslag, we beschrijven de toepassing van deze technologie om verschillende aspecten van het invriesproces en verschillende parameters die invloed hebben en waar en op welke temperatuur ijs ingeleid planten bestuderen. Een protocol zal worden dat de capaciteit van de ijs nucleatie-actieve (INA) bacterie Pseudomonas syringae (Cit-7) fungeren als extrinsieke nucleator initiërende bevriezing kruidachtige plant bij een hoge, temperaturen onder nul demonstreren.
High-resolution Infrared Camera
Het protocol en voorbeelden gedocumenteerd in dit rapport gebruik van een hoge resolutie infraroodvideo radiometer. De radiometer (figuur 1) levert een combinatie van infrarode en zichtbare spectrum afbeeldingen en temperatuurgegevens. De spectrale respons van de camera in het traject van 7,5-13,5 pm en levert 640 x 480 pixel resolutie. Zichtbare spectrum afbeeldingen gegenereerd door de ingebouwde camera kan worden gefuseerd met IR-beelden in real time, wat de interpretatie van complexe infraroodbeelden vergemakkelijkt. Een reeks van lenzen voor de camera kan worden gebruikt om close-up en microscopische observaties te maken. De camera kan gebruikt worden in een stand-alone mode of gekoppeld en gecontroleerd met behulp van een laptop propietary software. De software kan worden gebruikt om een verscheidenheid van thermische data ingebed in de opgenomen video te verkrijgen. Het is belangrijk op te merken dat een groot aantal infrarood radiometers zijn commercieel verkrijgbaar. Daarom is het essentieel dat de onderzoeker over hun beoogde toepassing met een deskundige productengineer en dat de onderzoeker test het vermogen van elke specificatiesc radiometer om de benodigde informatie te verstrekken. De imaging radiometer in het protocol beschreven wordt in een acrylaat (afbeelding 2) geïsoleerd met Styrofoam i n om de blootstelling ontmoedigen om condensatie tijdens de opwarming en afkoeling protocols. Deze bescherming is niet noodzakelijk voor alle camera's of toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Water heeft de mogelijkheid om onderkoeling bij temperaturen onder 0 ° C en de temperatuur waarbij water bevriest kan heel variabel zijn. 36 De grenstemperatuur voor onderkoeling van zuiver water is ongeveer -40 ° C en wordt gedefinieerd als homogene nucleatie punt. Wanneer water bevriest bij temperaturen warmer dan -40 ° C wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van heterogene kiemvormers waarmee kleine ice embryo te vormen die dan dienen als een katalysator voor ijsvorming en groei. 37 Er zijn …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Oostenrijkse Science Fund (FWF): P23681-B16.
Materials
| Infrared Camera | FLIR | SC-660 | Many models available depending on application |
| Infrared Analytical Software | FLIR | ResearchIR 4.10.2.5 | $3,500 |
| Pseudomonas syringae (strain Cit-7) | Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California Berkeley icelab@berkeley.edu | ||
| Pseudomonas Agar F | Fisher Scientific | DF0448-17-1 |
Referencias
- Taschler, D., Beikircher, B., Neuner, G. Frost resistance and ice nucleation in leaves of five woody timberline species measured in situ during shoot expansion. Tree Physiol. 24, 331-337 (2004).
- Neuner, G., Hacker, J., Lütz, C. Ice formation and propagation in alpine plants. Plants in alpine regions: Cell Physiology of adaptation and survival strategies. , 163-174 (2012).
- Ladinig, U., Hacker, J., Neuner, G., Wagner, J. How endangered is sexual reproduction of high-mountain plants by summer frosts? – Frost resistance, frequency of frost events and risk assessment. Oecologia. 171, 743-760 (2013).
- Wisniewski, M. E., Gusta, L. V., Fuller, M. P., Karlson, D., Gusta, L. V., Wisniewski, M. E., Tanino, K. K. Ice nucleation, propagation and deep supercooling: the lost tribes of freezing studies. Plant Cold Hardiness: from the laboratory to the field. , 1-11 (2009).
- Bokhurst, S., Bjerke, J. W., Davey, M. P., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Laine, K., Callaghan, T. V., Phoenix, G. K. Impacts of extreme winter warming events on plant physiology in a sub-Arctic heath community. Physiol. Plant. 140, 128-140 (2010).
- Taulavuori, K., Laine, K., Taulavuori, E. Experimental studies on Vaccinium myrtillus.and Vaccinium vits-idea.in relation to air pollution and global change at northern high latitudes: A review. Env. Exp. Bot. 87, 191-196 (2013).
- Wisniewski, M., Glenn, D. M., Gusta, L., Fuller, M. Using infrared thermography to study freezing in plants. HortScience. 43, 1648-1651 (2008).
- Gu, L., et al. The 2007 eastern US spring freeze: increased cold damage in a warming world. BioScience. 58, 253-262 (2008).
- Augspurger, C. K. Spring warmth and frost: phenology, damage, and refoliation in a temperate deciduous forest. Func. Ecol. 23, 1031-1039 (2007).
- Neuner, G., Erler, A., Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J. Frost resistance of reproductive tissues in various reproductive stages of high alpine plant species. Physiol. Plant. 147, 88-100 (2013).
- Skre, O., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Nilsne, J., Igeland, B., Laine, K. The importance of hardening and winter temperature for growth in mountain birch populations. Env. Exp. Bot. 62, 254-266 (2008).
- Hänninen, H., Tanino, K. Tree seasonality in a warming climate. Trends in Plant Science. 16, 412-416 (2011).
- Katz, R. W., Brown, B. G. Extreme events in a changing climate: variability is more important than averages. Climate Change. 21, 289-302 (1992).
- Wisniewski, M., Gusta, L. Understanding plant cold hardiness: an opinion. Physiol. Plant. 147, 4-14 (2013).
- Wisniewski, M., Gusta, L., Neuner, G. Adaptive mechanisms of freeze avoidance in plants. A brief update. Env. Exp. Bot. 99, 133-140 (2014).
- Burke, M. J., Gusta, L. V., Quamme, H. A., Weiser, C. J., Li, P. H. Freezing and injury in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 27, 507-528 (1976).
- Ishikawa, M., Price, W. S., Ide, H., Arata, Y. Visualization of freezing behaviors in leaf and flower buds of full-moon maple by nuclear magnetic resonance microscopy. Plant Physiol. 115 (4), 1515-1524 (1997).
- Ishikawa, M., Sakai, A., Li, P. H., Sakai, A. Characteristics of freezing avoidance in comparison with freezing tolerance: a demonstration of extra-organ freezing. Plant cold hardiness and freezing stress. , 325-340 (1982).
- Buchner, O., Neuner, G. Freezing cytorrhysis and critical temperature thresholds for photosystem II in the peat moss Sphagnum capillifolium. Protoplasma. 243 (1), 63-71 (2010).
- Pearce, R. S. Extracellular ice and cell shape in frost-stressed cereal leaves: A low temperature scanning electron microscopy study. Planta. 175, 313-324 (1988).
- Ashworth, E. N., Anderson, J. A., Davis, G. A., Lightner, G. W. Ice formation in Prunus persica. under field conditions. J. Am. Soc. Hort. Sci. 110 (3), 322-324 (1985).
- Ashworth, E. N., Davis, G. A. Ice formation in woody plants under field conditions. HortSci. 21, 1233-1234 (1986).
- Pramsohler, M., Hacker, J., Neuner, G. Freezing pattern and frost killing temperature of apple (Malus domestica.) wood under controlled conditions and in nature. Tree Physiol. 32 (7), 819-828 (2012).
- Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. N. Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography. Plant Physiol. 113 (2), 327-334 (1997).
- Lutze, J. L., et al. Elevated atmospheric [CO2] promotes frost damage in evergreen tree seedlings. Plant Cell Environ. (6), 631-635 (1998).
- Ball, M. C., et al. Space and time dependence of temperature and freezing in evergreen leaves). Func. Plant Biol. 29 (11), 1259-1272 (2002).
- Sekozawa, Y., Sugaya, S., Gemma, H. Observations of ice nucleation and propagation in flowers of Japanese Pear (Pyrus Pyrifolia). Nakai) using infrared video. 73 (1), 1-6 (2004).
- Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in plants visualized at the tissue level by IDTA (infrared differential thermal analysis). Tree Physiol. 27, 1661-1670 (2007).
- Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in dehardened alpine plant species studied by infrared differential thermal analysis (IDTA). Arc. Antarc. Alp. Res. 40 (4), 660-670 (2008).
- Hacker, J., Spindelböck, J., Neuner, G. Mesophyll freezing and effects of freeze dehydration visualized by simultaneous measurement of IDTA and differential imaging chlorophyll fluorescence. Plant Cell Environ. 31, 1725-1733 (2008).
- Neuner, G., XU, B., Hacker, J. Velocity and pattern of ice propagation and deep supercooling in woody stems of Castanea sativa., Morus nigra. and Quercus robur. measured by IDTA. Tree Physiol. 30, 1037-1045 (2010).
- Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J., Neuner, G. Inflorescences of alpine cushion plants freeze autonomously and may survive subzero temperatures by supercooling. Plant Sci. 180, 149-156 (2011).
- Kuprian, E., Briceno, V., Wagner, J., Neuner, G. Ice barriers promote supercooling and prevent frost injury in reproductive buds, flowers and fruits of alpine dwarf shrubs throughout the summer. Env. Exp. Bot. 106, 4-12 (2014).
- Wisniewski, M., Glenn, D. M., Fuller, M. Use of a hydrophobic particle film as a barrier to extrinsic ice nucleation in tomato plants. HortScience. 127, 358-364 (2002).
- Aryal, B., &Neuner, G. Leaf wettability decreases along an extreme altitudinal gradient. Oecologia. 162, 1-9 (2010).
- Wisniewski, M., Fuller, M. P., Margesin, R., Schinner, F. . Ice nucleation and deep supercooling in plants: new insights using infrared thermography. In: Cold adapted organisms. Ecology, physiology, enzymologyandmolecularbiology. , 105-118 (1999).
- Franks, F. . Biophysics and biochemistry at low temperatures. , (1985).
- Neuner, G., Kuprian, E., Hincha, D., Zuther, E. Infrared thermal analysis of plant freezing processes. Methods in Molecular Biology: Plant Cold Acclimation. , 91-98 (2014).
