Experimentele Demyelinisatie en Remyelinisatie van Muriene Spinal Cord door Focal Injectie van lysolecithine

NB: De in deze procedure dieren werden verzorgd in overeenstemming met de Canadese Raad over Animal Care (CCAC) richtlijnen. Ethiek werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Calgary. 1. Bereid Spuit voor Injectie Los lysolecithine een 1% oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7,4) en bewaar bij -20 ° C in kleine porties (75 pl). Dooi een flacon tot kamertemperatuur. OPMERKING: als lysolecithin is onopgelost, ultrasone trillingen de buis in een ultrasoon reiniger (40 kHz) gedurende ongeveer 30 minuten tot een gelijkmatige oplossing te vormen. Omgaan met de pre-getrokken glazen capillaire met uiterste zorg te voorkomen dat schade aan de delicate tip. Moer van een 10 pl injectie spuit en haal op het platte uiteinde van de capillair, gevolgd door 2 ferrules, zodat de parende einden van de ferrules richten en de capillaire strak in de konische klemring (figuur 1). Spoel de spuit met isopropyl alcohol en verwijder de zuiger. Eenmaal droog, schroef de naald assemblage hand vast op het injecteren spuit. Bevestig de metalen hub naald naar de priming spuit. Pierce een rubberen schijf met de naald en schuif deze naar beneden naar de basis. Vul de priming spuit met lysolecithine. Druk zachtjes de priming spuit totdat vloeistof zichtbaar is op het puntje van de naald. Hierdoor luchtbellen niet worden ingebracht in het injecteren spuit. Steek de metalen hub naald van de priming spuit in het injecteren spuit. Het maken van een stevige afdichting met de rubberen schijf, langzaam druk de priming spuit totdat de capillaire vult aan het uiteinde met de oplossing. Verwijder voorzichtig de priming spuit terwijl tegelijkertijd indrukken om de loop van het injecteren van injectiespuit te vullen zonder dat er luchtbellen. Breng de zuiger in de spuit injecterende en waarborgen oplossing stroomt uit de punt van de capillair als de plunjer zachtjes ingedrukt. OPMERKING: Als er luchtbellen zichtbaar zijn in de dopIllary of injecteren spuit, moet de spuit voorbereiding worden herhaald vanaf het begin. Continue fluïdum in de injecteerapparaat kritisch nauwkeurige injectievolume waarborgen. Bevestig de ingevulde injecteren spuit aan de arm van een stereotactische micromanipulator. Dit voltooide inrichting kunnen tot 15-20 dieren injecteren voordat ze moeten worden bijgevuld. Gooi de resterende lysolecithin van de priming spuit. In te trekken en druk isopropylalcohol meerdere malen, en maak de metalen hub naald. Wacht enkele uren voor de resterende isopropylalcohol in de priming spuit te laten verdampen alvorens opnieuw te vullen. 2. Bereid Animal voor chirurgische ingreep OPMERKING: Deze procedure is beschreven voor vrouwelijke C57BL / 6 muizen, 8-10 weken leeftijd. Verdoven het dier met een intraperitoneale injectie van ketamine (200 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) of per institutionele dierenzorg voorschriften. Plan voor dedier onder narcose ongeveer 1 uur indien injecteerbare verdoving. Test dat het dier diep wordt verdoofd door stevig knijpen de voet. Een goed verdoofd dier zal niet reageren op de knel. Met tondeuse, scheren 2-3 cm2 gebied aan de dorsale zijde van het dier dichtbij de oren. Wees voorzichtig niet om de oren te beschadigen. Veeg het gebied schoon met 70% ethanol toegepast op een gaasje. Zorg ervoor dat alle geknipt haar is verwijderd uit het gebied. Ontsmet het gebied met jodium. Vaseline voor de ogen droging gedurende de procedure te voorkomen. Houd het dier in een verwarmde recovery kamer tot klaar om de procedure te starten. 3. Voer de chirurgische ingreep OPMERKING: Zorg voor voldoende aseptische techniek voor alle stappen van de procedure. Dit geldt ook voor het juiste gebruik van handschoenen, haarnetjes, maskers, en gordijnen. Alle instrumenten moeten worden gesteriliseerd voordat ze in contact met het dier. Verplaats het dier naar een stereotactische frame, dorsale kant naar boven, verheven op het midden gedeelte door gevouwen papieren handdoeken om de kromming van de wervelkolom te overdrijven. Bevestig de armen en staart met chirurgische tape en zet het hoofd met een tand klem. Stabiliserende oor bars zijn niet nodig voor deze procedure. Gebruik een scalpel een 3 cm middellijn incisie vanaf net onder de oren en snijden in de caudale richting. Zoek de kloof tussen de 2 grote vet- structuren en gebruik fijne tang in elke hand om deze uit elkaar te trekken. Verspreid oprolmechanismen het chirurgisch veld te openen. Onder een chirurgische microscoop, zoekt de prominente uitgroei proces van de T2 wervel (Let op: deze functie is kenmerkend voor de C57BL / 6 muis stam). Voer een stompe dissectie met gesloten voorjaar een schaar door de superpositie spieren beter te visualiseren T2. Met behulp van de tang, voelen voor de harde oppervlakken van T3 en T4 om de juiste anatomische locatie te bevestigen. Met behulp van de lente schaar, maken ondiepe laterale bezuinigingen (2-3 mm diep) van het bindweefsel tussen T3 en T4. Vanwege de natuurlijke afstand tussen wervels in de thoracale deel van de wervelkolom muis, een laminectomie niet nodig om het ruggenmerg te onthullen. Wees bewust dat te diep een cut zal doorboren en schade aan het snoer. OPMERKING: Een kleine mate van bloeden is gebruikelijk tijdens deze stap. Als dit gebeurt, houdt een spons speer in het gebied tot de bloeding afneemt (30-60 sec). Visualiseer het ruggenmerg. Het zal worden bedekt met een dikke laag zichtbaar dura indien meningeale laag nog niet werd onderbroken terwijl het blootstellen van het snoer. Een prominente bloedvat loopt caudale / rostral door de geschatte middellijn van het ruggenmerg. LET OP: Deze vaatstelsel mag niet worden gebruikt als een mijlpaal voor de middellijn. In plaats daarvan moet voldoende verlichting van de grijs-witte stof grenzen aan weerszijden van de dorsale kolom te onthullen, en deze moeten worden gebruikt voor het schatten van de middellijn. Als de duraintact blijft, maken zachte laterale schraapt met een 32 G metalen naald totdat het wordt gewist. Het doel is om de dura verwijderen terwijl niet het snijden van de overige onderliggende hersenvliezen, die niet zo dik en moeilijker te zien. OPMERKING: introductie van cerebrospinale vloeistof geeft een schending van de arachnoid en hoewel dit kan optreden zonder mechanische schade aan het weefsel, zou de geaccumuleerde cerebrospinale vloeistof worden verwijderd met een spons speer beter visualiseren het oppervlak van het koord. Verplaats de injectie spuit in plaats langzaam zakken totdat het uiteinde van de capillair nauwelijks raakt het ruggenmerg direct lateraal van beide zijden van de middellijn. Vergrendelen van de arm op zijn plaats. Gebruik de gesorteerde metingen van de Z-richting stereotactische arm een ​​uitgangspositie meting. Uit deze lezing aftrekken 1.3 mm. Gebruik maken van een snelle en ondiepe neerwaartse beweging om het weefsel te doorboren en dan kantel de capillaire totdat de nieuwe meting is bereikt. Facultatief: desgewenst,laesies in de dorsale kolom kan worden geproduceerd door dezelfde piercing motie bij de middellijn en een diepte van 0,3 mm (zie bespreking voor meer informatie). Opmerking: Deze waarden zijn specifiek voor het injecteren van T3 en T4. Indien kiezen voor de injectie voeren op welke plaats in het ruggenmerg, moet deze waarde worden afgeleid van elk beschikbaar muizenhersenen atlas. Gebruik de micromanipulator om lysolecithine druk in de ventrale ruggenmerg witte stof. Voeg 1 rotatie van de micromanipulator elke 5 seconden gedurende 2 min, resulterend in een uiteindelijk volume van 0,5 pl. Laat de capillaire in de plaats voor 2 extra minuten om terugstromen van de oplossing te voorkomen, en dan verwijder voorzichtig het capillair. Maak een enkele hechting in de spier / vetweefsel overlappen de wervelkolom. Gebruik een niet-onderbroken hechting aan de huid te sluiten. Breng meer jodium aan de incisie. Plaats het dier in een verwarmde recovery kamer totdat het zich herstelt, dan terug naar zijn kooi. Solliciteer analgetica post-operatief als per institutionele dierverzorging regelgeving. Extra postoperatieve zorg is meestal niet nodig omdat de dieren volledig ambulant en zichzelf kan voeden en drinken zodra herstel van anesthesie. Herhaal de procedure voor de resterende dieren. OPMERKING: Bij vaardigheid, de bediening kan worden in 10-15 minuten per dier aangevuld, vooral met behulp van een tweede persoon binden hechtingen. Hetzelfde glas capillair kan voor ongeveer 15-20 operaties voor de tip bot wordt en moet worden vervangen. Controle operaties kunnen identiek worden uitgevoerd zoals beschreven, met een injectie van PBS in het ruggenmerg in plaats van lysolecithine. We raden niet aan het schoonmaken van de haarvaten voor toekomstig gebruik. 4. Tissue verwerking en analyse Offer de dieren een intraperitoneale overdosis van ketamine (500 mg / kg) en xylazine (25 mg / kg) op gewenste tijdstippen. Laesies meestal evolueren in de follvanwege manier: 1-3 dagen, actieve demyelinisatie; 3-7 dagen, OPC aanwerving; 7-10 dagen, oligodendrocyte differentiatie; 10-21 dagen, actieve remyelination 2,10,11. Om weefsel voorbereiding histologie, eerst een transcardial perfusie 12 voeren met 20 ml RT PBS gevolgd door 20 ml ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS. Voor de bereiding van hars ingebed weefsel voor semi- of ultradunne snijden, zie stap 4.9. Verwijder het ruggenmerg met gebogen been schaar door elk wervels vanaf het cervicale uiteinde van de wervelkolom en omlaag werkt naar de lagere thoracale af te scheren. Bevestig het ruggenmerg O / N in 4% paraformaldehyde in PBS bij 4 ° C. Schakel de koorden 30% sucrose in PBS bij 4 ° C gedurende ten minste 72 uur. Identificeer de injectieplaats als afwijkingen op het dorsale oppervlak van het ruggenmerg. Snijd een 3 mm stukje weefsel (met de plaats van injectie in het midden) en lijn de stukken in cryomolds met optimale snijtemperatuur (oktober) compound. Hang de onderkant van de cryomolds in een gekoelde mengsel van 2-methylbutaan en droog ijs tot het oktober is volledig bevroren. Bewaren bij -80 ° C tot klaar om sectie. Sectie het ruggenmerg op een cryostaat op een breedte van 20 urn op objectglaasjes en aan de lucht drogen O / N alvorens de objectglaasjes bij -20 ° C. Detecteren laesie locatie en grootte met behulp van een eriochroomcomplex cyanine- histologische vlek van myeline 13. Voer alle stappen bij RT. Lucht drogen dia's voor 30 min. Plaats de glaasjes in klaringsmiddel gedurende 1 min gevolgd door rehydratatie in gegradeerde ethanol-oplossingen (100%, 95%, 90%, 70%, 50% water) gedurende 1 min elk. Plaats de glaasjes in eriochroomcomplex cyanine oplossing gedurende 15 min, gevolgd door 1 min wassen met water. Onderscheid in 0,5% ammoniumhydroxide gedurende 10 sec, gevolgd door 1 min wassen met water. Uitdrogen in ethanolreeks oplossingen (omgekeerde volgorde zoals hierboven beschreven) gedurende 1 minuut per stuk, dekglaasje met montage media en beeld op een fel-veld microscope. Gebruik immunohistochemie om axonen en myeline visualiseren. Lucht drogen dia's voor 30 min. Dehydrateer met gegradeerde ethanol (water, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) gedurende 2 min elk bij kamertemperatuur, daarna omgekeerde volgorde naar water. Deze stap resulteert in hogere resolutie individuele myeline ringen 14. Blokkeer niet-specifieke antilichaam interacties met 10% geit serum en 0,25% Triton X-100 in PBS gedurende 60 min bij kamertemperatuur. Verdun primaire antilichamen (muis anti-SMI312 1: 2000, konijn anti-MBP 1: 1000) in PBS en incubeer op objectglaasjes O / N bij 4 ° C. Was 5 keer gedurende 5 min met PBS bij kamertemperatuur. Verdun secundaire antilichamen (Alexa 488 anti-konijn 1: 500, Alexa 546 anti-muis 1: 500) in PBS en incubeer op objectglaasjes gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Was 5 keer gedurende 5 min met PBS bij kamertemperatuur. Mount glijdt met dekglaasjes behulp gelvatol en beeld op een fluorescentiemicroscoop. Gebruik immunohistochemie cellen van de oligodendrocyt lijn visualiseren. Volg de procedure voor step 4.7, met weglating van de uitdroging / rehydratie stap, en het gebruik van 10% paard serum in plaats van geitserum. Gebruik de volgende primaire antilichaam verdunningen: geit anti-PDGFRα 1: 100, muis anti-CC1 1: 200, konijn anti-Olig2 1: 200. Gebruik de volgende secundaire antilichaam verdunningen: Alexa 488 anti-geit 1: 500, Alexa 594 anti-muis 1: 500, Alexa 647 anti-konijn 1: 500. Om weefsel bereiden semi- of ultradunne snijden eerst een transcardial perfusie 12 voeren met 20 ml RT PBS gevolgd door 20 ml ijskoude 4% paraformaldehyde / 1% glutaaraldehyde in PBS. Verwijder ruggenmerg zoals beschreven in stap 4.3. Fix O / N in 4% paraformaldehyde / 1% glutaaraldehyde in PBS bij 4 ° C. Identificeer de injectieplaats zoals beschreven in stap 4.4. Snij een 1 mm stukje weefsel dat de injectieplaats. Extra 1 mm blokken aan weerszijden van de laesie kan ook worden bereid indien gewenst. In een zuurkast, voeg 10 maal volume 1% osmiumtetroxide / 1,5% kaliumferrocyanide om elk blok op het ijs60 min. OPMERKING: osmiumtetroxide is een zeer giftige stof en moeten met uiterste zorg worden behandeld. Alle materialen in contact met osmiumtetroxide moeten maïsolie (tweemaal volume osmiumtetroxide oplossing) worden geplaatst voor neutralisatie. Was koorden 3 maal met 0,2 M cacodylaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur Werp in maïsolie. Dehydrateer met gegradeerde ethanol-oplossingen (water, 50%, 70%, 90%, 2 maal met 95%, 2 maal met 100%, 2 maal met propyleenoxide) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Insluiten snoeren in hars volgens de instructies van de fabrikant. Snij blokken op een ultramicrotoom en monteer secties op waterdruppels op objectglaasjes. Plaats de glaasjes op een hete plaat (ongeveer 50 ° C) tot droog. Visualiseer myeline door toevoeging van enkele druppels 1% toluidine blauw / 2% borax oplossing op de objectglaasjes gedurende 10-15 seconden bij 50 ° C. Spoelen met water, droog en dekglaasje met montage media. Afbeelding delen op een heldere-veld microscoop.