Lisolesitin Odak Enjeksiyon Deneysel Demyelizasyon ve Kemirgen Omurilik remiyelinizasyon

NOT: Bu prosedürde kullanılan hayvanlar Hayvan Bakımı Kanada Konseyi (CCAC) kurallarına uygun olarak bakım için. Etik Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Enjeksiyon için Şırınga hazırlayın (PH 7.4 PBS) ve mağaza, küçük kısımlar halinde -20 ° C (75 ul) içeren fosfat tamponlu tuzlu su içinde bir% 1 çözelti ile lisolesitin çözündürülür. RT bir şişe çözülme. Not: lisolesitin, çözünmemiş ise, bir tekdüze çözelti oluşturmak için yaklaşık 30 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyici (40 kHz), tüp sonikasyon. Hassas ucu zarar vermemek için çok dikkatli önceden çekti cam kapiller Kolu. 10 ul enjekte şırınga somunu sökün ve yüksüklerinin çiftleşme uçları hizalayın ve kılcal konik yüksük (Şekil 1) rahat olmasını sağlamak, 2 yüksükler ardından kılcal düz ucuna üzerine geçirin. Izopropil ile şırınga durulayınil alkol ve pistonu çıkartın. Kuru kez, enjekte şırınga üzerine sıkı iğne düzeneği elini sıkın. Astar şırınga metal göbek iğne takın. Pierce iğne ile bir lastik disk ve tabanına aşağı doğru kaydırın. Lizolesitin ile astar şırınga doldurun. Sıvı iğne ucu görünür kadar hafifçe priming şırınga basın. Bu hava kabarcıkları enjekte şırınga içine olmayacak sağlar. Enjekte şırınga içine astar şırınga metal göbek iğne takın. Kılcal çözeltisi ile ucu doldurana kadar lastik disk ile bir firma mühür yapma, yavaş yavaş priming şırınga basın. Aynı anda hava kabarcıkları tanıtan olmadan enjekte şırınga varil doldurmak için basarken dikkatli astar şırınga çıkarın. Enjekte şırınga içine pistonu takın ve piston hafifçe basıldığında gibi çözüm kılcal ucundan akar sağlamak. NOT: Herhangi bir hava kabarcıkları kap görünür isenizIllary veya şırınga enjekte şırınga hazırlık başından itibaren tekrar edilmelidir. Enjekte tertibatında sürekli sıvı doğru enjeksiyon hacimlerini sağlamak için çok önemlidir. Stereotaktik mikromanipülatör koluna tamamlanmış şırınga enjekte takın. Bu tamamlanmış cihaz doldurulmuş gerek önce 15-20 hayvan enjekte mümkün olacak. Astar şırınga kalan lisolesitin atın. Çekiniz ve izopropil alkol birkaç kez basın ve metal göbek iğne ayırın. Tekrar doldurmadan önce buharlaşması hazırlama şırınga kalan izopropil alkol birkaç saat bekleyin. 2. Cerrahi Prosedür için Hayvan hazırlayın NOT: Bu prosedür dişi C57BL / 6 fareleri, yaş 8-10 hafta için bir işlem açıklanmaktadır. Ketamin (200 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ya da kurumsal hayvan bakım düzenlemelerine göre bir intraperitonal enjeksiyon ile hayvan anestezisi. PlanıEnjekte anestezi kullanıyorsanız hayvan yaklaşık 1 saat anestezi altında olmak. Hayvan derinden sıkıca ayak kısma anestezi olduğunu test edin. Düzgün anestezi hayvan tutam yanıt vermez. Makası kullanarak, kulağına yakın hayvanın, dorsal tarafında 2-3 cm 2 alan tıraş. Kulakları zarar vermemek için dikkatli olun. Bir gazlı bez uygulanan% 70 etanol ile temiz alana silin. Tüm kırpılmış saç alanından kaldırıldı emin olun. Iyot ile bölgeyi dezenfekte edin. Prosedür boyunca kurumasını önlemek için gözlere vazelin uygulayın. Prosedürü başlatmak için hazır olana kadar ısıtılmış bir kurtarma odasında hayvan tutun. 3. Cerrahi Prosedürü gerçekleştirin NOT: prosedürünün tüm adımlar için yeterli aseptik tekniğini emin olun. Bu eldiven, hairnets, maskeler ve perdeler doğru kullanımını içerir. Tüm araçlar temas bilgilerini gelmeden önce sterilize edilmelidirhayvan ile t. Bir stereotaktik çerçeve ile hayvan taşımak, dorsal yüzü yukarı, omurga eğriliği abartmak katlanmış kağıt havlu ile orta bölümünde yüksek. Cerrahi bant ile silah ve kuyruk sabitleyin ve bir diş kelepçe ile baş sabitleyin. Dengeleyici kulak çubukları, bu işlem için gerekli değildir. Kulakların hemen altındaki başlayan ve kaudal yönde kesim, 3 cm'lik orta hat kesi yapmak için bir neşter kullanın. 2 büyük yağ yapıları arasındaki bölünmeyi bulun ve bu ayrı çekmek için her el ince forseps kullanabilir. Cerrahi alan açmak için Ekartörleri yayıldı. Bir cerrahi mikroskop altında, T2 vertebra belirgin sonucudur sürecini bulun (Not: Bu özellik C57BL / 6 fare zorlanma karakteristik). Daha T2 görselleştirmek için üstlerinde kas yoluyla kapalı yaylı makas ile künt diseksiyon gerçekleştirin. Forseps kullanarak, uygun anatomik konumu onaylamak için T3 ve T4 sert yüzeyler için üzülüyorum. Yaylı makas kullanarak, T3 ve T4 arasındaki bağ dokusu (2-3 mm derinliğinde) sığ yan keser. Nedeniyle fare omurga kolonunun üst göğüs kısmı da omur arasındaki doğal aralık için, laminektomi omurilik ortaya çıkarmak için gerekli değildir. Çok derin bir kesik delmek ve kablosuna zarar edeceği dikkatli olun. NOT: kanama küçük bir derecede bu aşaması esnasında yaygındır. Bu durum ortaya çıkarsa, kanama Subsidies (30-60 sn) kadar alana bir sünger mızrak tutun. Omuriliği gözünüzde canlandırın. Kablosunu teşhir ederken bu meningeal tabaka henüz kesilmiş değil eğer görünür dura kalın bir tabaka ile kaplı olacaktır. Tanınmış bir kan damarı omurilik yaklaşık orta hat boyunca kaudal / rostral çalışır. NOT: Bu damar orta hatta bir işareti olarak kullanılmamalıdır. Bunun yerine, yeterli aydınlatma dorsal sütun yan gri-beyaz cevher sınırlarını açığa çıkarmalıdır ve bu orta hat tahmin için kullanılmalıdır. Dura Eğertemizlenene kadar bozulmadan kalır, bir 32 G, metal iğne ile nazik yanal scrapes yapmak. amaç olarak kalın ve görmek zor değildir kalan temel meninksler, kesim olmasa da dura kaldırmaktır. NOT: beyin omurilik sıvısının Yayın araknoid ihlal gösterir ve bu dokuya mekanik zarar vermeden oluşabilir ise, birikmiş beyin omurilik sıvısı daha kord yüzeyini görselleştirmek için bir sünger mızrak ile çıkarılmalıdır. Yerinde şırınga enjekte ettirin ve kılcal ucu zar zor orta hat her iki tarafında hemen yan omuriliği dokunana kadar yavaşça indirin. Yerinde kolu kilitleyin. Bir temel pozisyon ölçümü yapmak için Z-yönü stereotaktik kol kademeli ölçümleri kullanın. Bu okuma, 1.3 mm çıkarmak. Doku delmek için hızlı ve sığ aşağı hareket kullanın ve yeni ölçüm ulaşılana kadar sonra dikkatlice kılcal indirin. İsteğe bağlı: istenirse,Dorsal sütununda lezyonlar orta hatta aynı delme hareketi ve 0.3 mm (Daha fazla bilgi için tartışmaya bakınız) bir derinliğe göre üretilebilir. NOT: Bu değerler T3 ve T4 arasında enjekte etmek için özeldir. Omurilik herhangi bir başka yerde enjeksiyon yapmak için tercih, bu değerler mevcut herhangi bir fare beyin atlas elde edilmesi gerekmektedir. Ventral spinal kord beyaz cevher içine lisolesitin bastırmak için mikromanipülatör kullanın. 0.5 ul nihai hacim içinde elde edilen, 2 dakika boyunca mikromanipülatör 1 rotasyonu, her 5 saniye olun. Çözeltinin geri akmasını önlemek için 2 ek dakika yerinde kılcal bırakın, ve daha sonra dikkatlice kılcal çıkarın. Omuriliğe kaplanacağı kas / yağ dokusunda tek sütür kravat. Cildi kapatmak için olmayan bir kesintiye dikiş kullanın. Kesi daha fazla iyot uygulayın. O iyileşene kadar, daha sonra kendi kafesine geri ısıtılmış kurtarma odasında hayvan yerleştirin. Analjezikler uygulayın sonrasıAmeliyat kurumsal hayvan bakım düzenlemelerine göre. Hayvanlar kısa sürede anestezi onlar kurtarma tam olarak ayaktan ve kendini besleme ve içme yeteneğine sahip gibi ek post-operatif bakım genellikle gerekli değildir. Kalan hayvanlar için prosedürü tekrarlayın. NOT: yeterlilik ile operasyon, özellikle sütür bağlama İkinci bir kişinin yardımıyla, hayvan başına 10-15 dakika içinde tamamlanabilir. ucu künt hale gelir ve değiştirilmesi gerektiğini önce aynı cam kılcal yaklaşık 15-20 ameliyatları için kullanılabilir. Yerine lizolesitin ve omuriliğe PBS enjeksiyonu ile, tarif edildiği gibi kontrol ameliyatları eşit yapılabilir. Biz ileride kullanmak üzere kılcal temizleme tavsiye etmiyoruz. 4. Doku İşleme ve Analiz İstenen zaman noktalarında ketamin (500 mg / kg) ve ksilazin (25 mg / kg) intraperitoneal doz aşımı ile hayvanlar kurban. Lezyonlar genellikle foll içinde gelişmeyenedeniyle şekilde: 1-3 gün, aktif demiyelinizasyon; 3-7 gün, OPC işe; 7-10 gün, oligodendrosit farklılaşması; 10-21 gün aktif remiyelinizasyon 2,10,11. Ilk önce PBS içinde 20 ml buz gibi soğuk% 4 paraformaldehid ile ve ardından 20 ml RT PBS ile transcardial perfüzyon 12 yerine, histoloji için doku hazırlanması. Yarı veya ultra ince kesit için reçine gömülü doku hazırlanması için, adım 4.9 bkz. Her omurların omurganın servikal sonunda başlayan ve alt torakal seviyesine kadar çalışarak kesmek için kavisli kemik makas kullanarak omurilik çıkarın. 4 ° C'de PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde omurilik O / N Düzelt. En az 72 saat için 4 ° C'de PBS içinde% 30 sakaroza kablolarını geçin. Omurilik dorsal yüzeyinde bir anormallik olarak enjeksiyon sitesini tanımlamak. (Merkezde enjeksiyon yerinde) ile doku 3 mm parça kesin ve optimal kesim sıcaklığının içeren cryomolds (Ekim) co parçaları hizalayınmpound. Ekim tamamen donmuş kadar 2-metilbütan ve kuru buz içinde soğutulmuş bir karışımı içinde cryomolds alt kısmını süspanse edin. Bölümüne kadar hazır -80 ° C'de saklayın. Mikroskop lamı üzerine 20 mikron genişliğinde bölüm kriostat spinal kablolarını ve hava kuru O izin / N -20 ° C'de slaytlar saklamadan önce. Miyelin 13 bir eriochrome Siyanin histolojik leke kullanılarak lezyon yerini ve boyutunu algılar. Oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın. 30 dakika için Hava kuru slaytlar. 1 dakika her biri için sınıflandırılmış etanol Çözeltilerin rehidrasyondan sonra 1 dakika boyunca (100,% 95,% 90,% 70,% 50,% su) ajan temizleme yeri kayar. Su ile, 1 dakika yıkama ve ardından 15 dakika boyunca eriochrome siyanin çözelti içinde yer kaymaktadır. Su ile, 1 dakika yıkama, ardından 10 saniye boyunca% 0.5 amonyum hidroksit ayırır. Parlak alan mi 1 dakika montaj ortamı, her biri lamel ve görüntü için (yukarıda tarif edildiği gibi ters sırada) dereceli etanol Çözeltilerin kurutmakmikroskop. Akson ve miyelin görselleştirmek için immunohistokimyasal kullanın. 30 dakika için Hava kuru slaytlar. Oda sıcaklığında 2 dakika her biri için kademeli etanol (su,% 50,% 70,% 90,% 95,% 100) ile kurutmak, daha sonra tekrar su kelimelerinin sırasını tersine çevirebilir. Bu adım, bireysel miyelin halkaları 14 daha fazla çözünürlük ile sonuçlanır. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca PBS içinde% 10 keçi serumu ve% 0.25 Triton X-100 kullanarak, spesifik olmayan antikor etkileşimi bloke eder. PBS ile 4 ° C sıcaklıkta / O slaytlar üzerinde N inkübe birincil antikor (1000: 2000, tavşan anti-MBP 1 fare anti-SMI312 1) ile seyreltilir. Oda sıcaklığında PBS ile 5 dakika için 5 kez yıkayın. PBS içinde ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca slaytlar üzerinde inkübe sekonder antikor (500: 500, Alexa 546, anti-fare 1 Alexa 488 anti-tavşan 1) ile seyreltilir. Oda sıcaklığında PBS ile 5 dakika için 5 kez yıkayın. Dağı bir floresan mikroskop GELVATOL ve görüntü kullanılarak lamelleri ile slaytlar. Oligodendrosit soy hücreleri görselleştirmek için immunohistokimyasal kullanın. St için prosedürü izleyinep 4.7, dehidratasyon / rehidrasyon adım atlama, ve% 10 at serumu yerine keçi serumu kullanarak. Aşağıdaki primer antikor seyreltileri kullanarak: keçi anti-PDGFRα 1: 100, fare anti-CC1 1: 200, tavşan anti-Olig2 1: 200. Alexa 488 anti-keçi 1: 500, Alexa 594 anti-fare 1: 500, Alexa 647 anti-tavşan 1: 500 Aşağıdaki ikincil antikor dilüsyonları kullanın. Ilk önce PBS içinde 20 ml buz gibi soğuk% 4 paraformaldehid /% 1 glutaraldehid, ardından 20 mi RT PBS ile transcardial perfüzyon 12 yerine, yarı veya ultra-ince kesit için doku hazırlanması. Adım 4.3'de tarif edildiği gibi omuriliğin çıkarın. 4 ° C'de PBS içinde O / N% 4 paraformaldehid /% 1 glutaraldehit düzeltildi. Adım 4.4 açıklandığı gibi enjeksiyon sitesini tanımlamak. Enjeksiyon bölgesi içeren doku, 1 mm'lik bir parça kesin. Arzu edildiği takdirde, lezyonun her iki tarafında ek 1 mm'lik blokları ile hazırlanabilir. Bir çeker ocak içinde, buz üzerinde, her blok 10 kat hacim% 1 ozmiyum tetroksit /% 1.5 potasyum ferrosiyanür eklemek60 dakika karıştırıldı. NOT: osmiyum tetroksit son derece zehirli bir maddedir ve aşırı dikkatle ele alınmalıdır. Ozmiyum tetroksit ile temas eden her türlü malzemenin nötrleştirme için mısır yağı (ozmiyum tetroksit çözeltisi olarak iki hacim) yerleştirilmelidir. Mısır yağı içinde atarak, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 0.2 M kakodilat kordon 3 kez yıkayın. Dereceli etanol solüsyonları (suda,% 50,% 70,% 90,% 95, 2 kat,% 100 ile 2 kez, propilen oksit ile 2 kez) ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca birlikte dihidrat. Üreticinin talimatlarına göre reçine embed kordonlar. Bir ultramicrotome blokları kesin ve mikroskop slaytlar üzerinde su damlacıkları üzerine bölümleri monte edin. Kuru kadar sıcak bir plaka (yaklaşık 50 ° C) yerleştirin kayar. 50 ° C'de 10-15 saniye boyunca slaytlar üzerine mavi,% 1 toluidin /% 2 boraks solüsyonu ve bir kaç damla eklenerek miyelin görselleştirmek. Montaj medya ile su, kuru, ve lamel ile durulayın. Parlak alan mikroskobu Görüntü bölümleri.