Экспериментальная Демиелинизация и ремиелинизацию мышиной спинного мозга Focal инъекций лизолецитина

ПРИМЕЧАНИЕ: животные, используемые в этой процедуре были уход в соответствии с Канадским советом по уходу за животными (ССАС) руководящих принципов. Этика были утверждены Care Комитета по Животным университета Калгари в. 1. Подготовьте шприц для инъекций Растворить лизолецитин в 1% -ном растворе в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS, рН 7,4) и хранят при -20 ° С в небольших аликвот (75 мкл). Оттепель флакон РТ. Примечание: Если лизолецитин является нерастворенного, разрушать ультразвуком трубку в ультразвуковом очистителе (40 кГц) в течение примерно 30 мин с образованием однородного раствора. Обращайтесь с предварительно вытащил стеклянный капилляр с особой осторожностью, чтобы не повредить нежную чаевые. Отвинтите гайку 10 мкл инъекционных шприца и пропустите его на плоскую конце капилляра, затем 2 наконечниками, гарантируя, что соединяемые концы наконечников выровнять и капиллярной уютно в конической манжеты (рисунок 1). Промойте шприц с isopropил спирт и удалить поршень. После высыхания, винтовые узла иглы руку плотно к инъекционным шприцем. Прикрепите металлический ступицы иглы для грунтовочного шприца. Пирс резиновые диск с иглой и сдвиньте его вниз до основания. Заполните грунтовки шприц с лизолецитина. Осторожно нажать на грунтовочное шприц, пока жидкость не видна на кончике иглы. Это гарантирует, воздушные пузырьки не будут введены в шприц для инъекций. Вставьте металлический ступицы иглы для подкачки шприца в инъекционного шприца. Создание фирмы уплотнение с резиновым диском, медленно нажать на заливную шприц, пока капиллярной не заполняет до кончика раствором. Осторожно снимите заливную шприц, одновременно нажимая, чтобы заполнить бочку инъекционных шприца без введения пузырьков воздуха. Вставить поршень в в инъекционного шприца и обеспечивать раствор течет от кончика капилляра, как поршень слегка нажата. ПРИМЕЧАНИЕ: Если видны в крышке пузырьки воздухаIllary или инъекционных шприцев, препарат Шприц должен быть повторен с самого начала. Непрерывная жидкости в инъекционного аппарата имеет решающее значение для обеспечения точных объемов закачки. Приложить заполненный инъекционного шприца в руку стереотаксической микроманипулятора. Это завершило аппарат сможет придать 15-20 животных до необходимости быть пополнен. Откажитесь от оставшегося лизолецитину от заливной шприц. Вывод и нажмите изопропиловый спирт несколько раз, и отсоедините металлический ступицы иглы. Подождите несколько часов, оставшихся изопропилового спирта в грунт шприца для испарения, прежде чем снова заполнения. 2. Подготовка животных для хирургической процедуры Примечание: Эта процедура описана для женщин C57BL / 6 мышей в возрасте 8-10 недель. Обезболить животное с внутрибрюшинной инъекции кетамина (200 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) или в институциональных правил по уходу за животными. Планживотное находится под анестезией в течение приблизительно 1 ч при использовании инъекционного наркоза. Тест, что животное глубоко под наркозом, крепко зажимая ногу. Правильно наркозом животное не будет реагировать на повышение. Использование машинки для стрижки, бритье 2-3 см 2 площади на спинной стороне животного, недалеко от ушей. Будьте осторожны, чтобы не повредить слух. Протрите место в чистоте с 70% этанола, примененного к марлевым тампоном. Убедитесь, что все обрезается волосы были удалены из этого района. Лечить области с йодом. Применение вазелин для глаз, чтобы предотвратить высыхание в течение всей процедуры. Держите животное в нагретой камере восстановления до готовности, чтобы начать процедуру. 3. Выполните хирургической процедуры ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить достаточную технику асептического для всех этапов процедуры. Это включает в себя правильное использование перчаток, сетки для волос, маски и шторы. Все инструменты должны быть стерилизованы до вступления в контакторовт с животным. Перемещение животное стереотаксической рамки, спинной стороной вверх, возведен в середине секции по бумажных полотенец преувеличивать искривление позвоночника. Закрепите руки и хвост с хирургической лентой и закрепите головку зажимом зуба. Стабилизация уха бары не являются необходимыми для этой процедуры. Используйте скальпель, чтобы сделать 3 см срединный разрез, начиная чуть ниже ушей и резки в каудальном направлении. Найдите разрыв между 2 больших жировых структур и использовать тонкий пинцет в каждой руке, чтобы вытащить их друг от друга. Распространение преднатяжителями, чтобы открыть операционного поля. Под операционным микроскопом, найдите видное процесс вырост T2 позвонка (Примечание: эта функция характерна штамма C57BL / 6 мыши). Выполните тупым с закрытыми весенних ножницами через покрывающей мускулатуру, чтобы лучше представить себе, Т2. Используя щипцы, чувствовать за твердыми поверхностями Т3 и Т4, чтобы подтвердить правильность анатомического расположения. Использование пружинных ножниц, сделать неглубокие боковые порезы (2-3 мм в глубину) соединительной ткани между T3 и T4. Благодаря естественной расстояние между позвонками в верхней грудной части позвоночника мыши, ламинэктомию нет необходимости раскрывать в спинной мозг. Будьте внимательны, что слишком глубоко вырезать пробьет и повредить кабель. ПРИМЕЧАНИЕ: малая степень кровотечения является общим во время этого шага. Если это происходит, не держать мочалку копье в области, пока кровотечение стихает (30-60 сек). Визуализация спинной мозг. Это будет покрыт толстым слоем видимой твердой мозговой оболочки, если это менингеальные слой еще не обрезается, подвергая питания. Известный кровеносных сосудов работает хвостовой / ростральной через приблизительной средней линии спинного мозга. Примечание: Этот сосудистую не должны быть использованы в качестве ориентира для средней линии. Вместо этого, достаточное освещение должно выявить границы серо-белого вещества фланговые спинной колонки, и они должны быть использованы для оценки средней линии. Если твердой мозговой оболочкиостается неизменным, сделать нежные боковые царапины с 32 г металлической иглой, пока она не будет устранена. Цель состоит в том, чтобы удалить твердую мозговую оболочку, а не резать оставшихся, лежащие в основе мозговых оболочек, которые не толстый, и трудно увидеть. ПРИМЕЧАНИЕ: Выпуск спинномозговой жидкости свидетельствует о нарушении паутинной и, хотя это может происходить без механического повреждения ткани, накапливается спинномозговой жидкости должны быть удалены с губкой копьем, чтобы лучше визуализировать поверхности шнура. Перемещение инъекционного шприца на месте и медленно опустите ее, пока кончик капилляра едва не коснется спинной мозг сразу же латеральнее обе стороны от средней линии. Блокировка руку на месте. Используйте градуированные измерения Z-направлении стереотаксической руку, чтобы сделать базовый измерение положения. От этого чтения, вычесть 1,3 мм. Используйте вниз быстро и неглубоко движение для прокалывания ткани, а затем осторожно опустите в капилляр до Новое измерение не будет достигнута. Дополнительно: при желании,повреждения в спинной колонки могут быть получены тем же движением пирсинг в средней линии и глубиной 0,3 мм (см обсуждения для получения дополнительной информации). ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения являются специфическими для потребителей инъекционных между T3 и T4. Если выбирают для выполнения инъекции в любом другом месте в спинном мозге, эти значения должны быть получены из любых доступных атлас мозга мыши. Используйте микроманипулятор нажимать лизолецитина в брюшной спинного мозга белого вещества. Сделать один поворот микроманипулятором каждые 5 секунд в течение 2 минут, в результате чего в конечном объеме 0,5 мл. Оставьте капилляр на месте в течение 2 дополнительных минут для предотвращения обратного потока раствора, а затем осторожно снимите капилляра. Свяжите одну нить в мышцы / жировой ткани, перекрывающей позвоночник. Используйте не-прерванной нити, чтобы закрыть кожу. Применить больше йода, в месте разреза. Поместите животное в нагретой камере восстановления до тех пор, пока не восстановится, то вернуть его в клетку. Применить анальгетики постоперативно, как в институциональных правил по уходу за животными. Дополнительная послеоперационный уход, как правило, не требуется, поскольку животные полностью амбулаторно-возможности самостоятельного кормления и поения, как только они выход из наркоза. Повторите процедуру для остальных животных. ПРИМЕЧАНИЕ: При языком, операция может быть завершена в 10-15 минут на животное, в частности, с помощью второго человека, связывая швов. Же стеклянный капилляр может быть использован в течение примерно 15-20 операций, прежде чем кончик становится тупой и должен быть заменен. Операции управления могут быть выполнены идентично, как описано, с введением PBS в спинной мозг, а не лизолецитин. Мы не рекомендуем очистки капилляров для дальнейшего использования. 4. Ткань обработка и анализ Пожертвовать животных внутрибрюшинной передозировки кетамина (500 мг / кг) и ксилазина (25 мг / кг) в желаемых временных точках. Поражения обычно развиваются в Фолляиз-за манера: 1-3 дня, активный демиелинизация; 3-7 дней, вербовка OPC; 7-10 дней, олигодендроцит дифференциация; 10-21 дней, активный ремиелинизации 2,10,11. Чтобы подготовить ткань для гистологического исследования, первый выполнить transcardial перфузии 12 с 20 мл PBS RT с последующим 20 мл ледяной 4% параформальдегида в PBS. Для приготовления смолы встроенного ткани для полу- или ультратонких срезов, см шаг 4,9. Удалить спинной мозг с помощью изогнутых ножниц кости, чтобы прорезать каждый позвонков, начиная с конца шейки позвоночника и рабочей вниз к нижней грудной уровне. Закрепите спинного мозга O / N в 4% параформальдегидом в PBS при 4 ° С. Переключатель шнуры до 30% сахарозы в PBS при 4 ° С в течение по меньшей мере 72 ч. Определение места инъекции в качестве аномалии на дорсальной поверхности спинного мозга. Вырезать 3 мм кусок ткани (с месте инъекции в центре) и совместите части в cryomolds, содержащие оптимальную температуру резания (OCT) COmpound. Приостановка нижнюю сторону cryomolds в охлажденной смеси 2-метилбутана и сухого льда до тех пор, пока октября полностью заморожены. Хранить при -80 ° С до готовности разделе. Раздел спинного мозга на криостате при ширине 20 мкм на предметных стеклах и дайте высохнуть на воздухе O / N до сохранения слайды при температуре -20 ° C. Обнаружение местоположения очага поражения и размер, используя eriochrome цианиновый гистологического пятно миелина 13. Выполните все шаги при комнатной температуре. Воздушно-сухой скользит в течение 30 мин. Место скользит в очистке агента в течение 1 мин, после чего регидратации в градуированных этанольных растворов (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, вода) в течение 1 мин каждый. Место слайды в eriochrome цианинового раствор в течение 15 мин, затем 1 мин промыть водой. Дифференцироваться в 0,5% гидроксида аммония в течение 10 сек, с последующим 1 мин промыть водой. Дегидрировать в градуированных этанола решений (в обратном порядке, как описано выше) в течение 1 мин каждый, покровное с монтажной средств массовой информации и изображения на ярко-полевых миcroscope. Используйте иммуногистохимии для визуализации аксонов и миелина. Воздушно-сухой скользит в течение 30 мин. Высушить с градуированной этанола (вода, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) в течение 2 мин каждый при комнатной температуре, а затем в обратном порядке обратно в воду. Этот шаг приводит к большей разрешения индивидуальных миелиновых колец 14. Блок неспецифических взаимодействий антител с использованием 10% козьей сыворотки и 0,25% Triton X-100 в PBS в течение 60 мин при комнатной температуре. Развести первичных антител (мышиного анти-SMI312 1: 2000, кролик анти-МВР 1: 1000) в PBS и инкубировали на слайдах O / N при 4 ° С. Промыть 5 раз в течение 5 мин с PBS при комнатной температуре. Развести вторичными антителами (Alexa 488 анти-кроличий 1: 500, Alexa 546 против мышиного 1: 500) в PBS и инкубировали на слайдах в течение 60 мин при комнатной температуре. Промыть 5 раз в течение 5 мин с PBS при комнатной температуре. Гора слайды с покровные использованием gelvatol и изображение на флуоресцентного микроскопа. Использование иммуногистохимии для визуализации клетки олигодендроцитов линии. Следуйте процедуре улEP 4,7, опуская стадии дегидратации / регидратации, и с использованием 10% лошадиной сыворотки вместо козьей сыворотки. Используйте следующие разведения первичных антител: анти-козел PDGFRα 1: 100, мышиного анти-CC1 1: 200, кролик анти-Olig2 1: 200. Используйте следующие вторичные разведения антител: Alexa 488 анти-козел 1: 500, Alexa 594 анти-мышь 1: 500, Alexa 647 анти-кролик 1: 500. Чтобы подготовить ткань для полу- или ультратонкой срезов, первый выполнить transcardial перфузии 12 с 20 мл PBS RT с последующим 20 мл ледяной 4% параформальдегида / 1% глутарового альдегида в PBS. Удалить спинной мозг, как описано в стадии 4,3. Закрепить O / N в 4% параформальдегид / 1% глутаральдегид в PBS при 4 ° С. Определить место инъекции, как описано в шаге 4.4. Вырезать 1 мм кусок ткани, содержащей в месте инъекции. Дополнительные блоки 1 мм по обе стороны от поражения, могут быть получены также, если это желательно. В вытяжном шкафу, добавить 10 раз 1% по объему четырехокиси осмия / 1,5% кровяной соли для каждого блока на льдув течение 60 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: четырехокись осмия является высокотоксичным веществом и должны быть обработаны с особой тщательностью. Все материалы, контактирующие с осмия должен быть помещен в кукурузном масле (дважды объема, как осмия раствора) для нейтрализации. Промыть 3 раза шнуров с 0,2 М какодилате в течение 10 мин при комнатной температуре, отбрасывая в кукурузном масле. Высушить с градуированными этанольных растворов (вода, 50%, 70%, 90%, 2 раза 95%, в 2 раза с 100%, 2 раза пропиленоксида) в течение 10 минут при комнатной температуре. Код для вставки шнуры в смоле в соответствии с инструкциями изготовителя. Вырезать блоки на ультрамикротоме и смонтировать разделы на капелек воды на предметных стеклах. Место скользит по горячей плите (примерно 50 ° С) до полного высыхания. Представьте миелин, добавив несколько капель 1% толуидиновым синим / 2% раствор буры на слайдах 10-15 сек при 50 ° С. Промыть водой, сухой и покровного с монтажными средствами массовой информации. Разделы изображение на ярко-поле микроскопа.