Experimental desmielinização e remielinização de Medula Espinhal Murino por Injeção Focal de lisolecitina

NOTA: Os animais utilizados neste procedimento foram tratados de acordo com a Canadian Council on Animal Care (CCAC) orientações. Ética foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animal da Universidade de Calgary. 1. Prepare a seringa para a injeção Dissolve-se lisolecitina para uma solução a 1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) e armazenar a -20 ° C em pequenas aliquotas (75 ul). Descongelar um frasco à temperatura ambiente. NOTA: se lisolecitina é não dissolvido, sonicar o tubo num aparelho de limpeza de ultra-sons (40 kHz) durante aproximadamente 30 minutos para formar uma solução uniforme. Lidar com o capilar de vidro pré-puxou com extremo cuidado para não danificar a ponta delicada. Desaperte a porca de uma seringa injetar 10 ul e passe-o para a parte plana do capilar seguido por 2 ponteiras, garantindo que os fins de acasalamento das virolas alinhar e capilar é confortável na ponteira cónica (Figura 1). Lavar a seringa com isopropálcool il e remover o êmbolo. Depois de seco, o parafuso do lado conjunto de agulha apertado na seringa de injeção. Coloque a agulha de metal hub para a seringa priming. Pierce um disco de borracha com a agulha e deslize-o para a base. Encha a seringa aspirante com lisolecitina. Suavemente deprimir a seringa priming até que o líquido é visível na ponta da agulha. Isto assegura bolhas de ar não será introduzido na seringa de injecção. Insira a agulha de metal hub da seringa priming para a seringa de injecção. Fazendo uma vedação firme com o disco de borracha, aperte lentamente a seringa preparação até que o capilar enche até a ponta com a solução. Remover cuidadosamente a seringa priming enquanto simultaneamente pressionando para encher o cilindro da seringa de injecção de sem introduzir bolhas de ar. Inserir o êmbolo na seringa de injecção e assegurar a solução flui a partir da ponta do capilar medida que o êmbolo é pressionado suavemente. NOTA: Se as bolhas de ar são visíveis na tampaIllary ou injecção de seringa, a preparação da seringa deve ser repetido desde o início. Fluido contínuo no aparelho de injecção é crítico para assegurar o volume de injecção precisos. Ligue a seringa injetar completou para o braço de um micromanipulator estereotáxica. Este aparelho completou será capaz de injectar 15-20 animais antes de precisar de ser reabastecido. Descartar a lisolecitina restante da seringa priming. Retirar e deprimir álcool isopropílico várias vezes, e retirar a agulha hub metal. Esperar algumas horas para que o álcool isopropílico restante na seringa priming para evaporar antes de encher novamente. 2. Prepare-se de animal para o procedimento cirúrgico NOTA: Este procedimento é descrito para o sexo feminino camundongos C57BL / 6, com idades entre 8-10 semanas. Anestesiar o animal com uma injecção intraperitoneal de cetamina (200 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) ou por regulamentação de cuidados de animais institucionais. Plano para aanimal a ser sob anestesia para cerca de 1 hora, se utilizar a anestesia injectável. Teste de que o animal é anestesiado profundamente com firmeza que comprime o pé. Um animal de devidamente anestesiados não vai responder ao aperto. Usando clippers, raspar a 2 cm área 2-3 no lado dorsal do animal, perto das orelhas. Tenha cuidado para não danificar os ouvidos. Limpe a área limpa com etanol 70% aplicada a uma compressa de gaze. Assegurar-se que o cabelo cortado foi removida da área. Desinfectar a área com iodo. Aplicar vaselina para os olhos para evitar a secagem durante todo o procedimento. Manter o animal em uma câmara de recuperação aquecida até que esteja pronto para iniciar o procedimento. 3. Execute o procedimento cirúrgico NOTA: Certifique-se de uma técnica asséptica adequada para todas as etapas do processo. Isso inclui o uso adequado de luvas, toucas, máscaras e cortinas. Todos os instrumentos devem ser esterilizados antes de vir em contact com o animal. Mova o animal a um quadro estereotáxico, lado dorsal up, elevada no meio, seção por toalhas de papel dobradas para exagerar a curvatura da coluna vertebral. Prenda os braços e cauda com esparadrapo e proteger a cabeça com um grampo de dente. Estabilizar barras de ouvido não são necessárias para este procedimento. Usar um bisturi para fazer uma incisão na linha média, 3 cm, começando logo abaixo das orelhas e corte na direcção caudal. Localize o fosso entre as duas grandes estruturas adiposas e usar uma pinça fina em cada mão para retirar estes apart. Espalhe afastadores para abrir o campo cirúrgico. Sob um microscópio cirúrgico, localize o processo de crescimento proeminente da vértebra T2 (Nota: este recurso é característica da C57BL / 6 do mouse estirpe). Realize uma dissecção romba com tesoura primavera fechados através da musculatura sobreposição para melhor visualizar T2. Usando a pinça, sentir para as superfícies duras de T3 e T4 para confirmar localização anatômica correta. Com uma tesoura primavera, fazer cortes laterais rasas (2-3 mm de profundidade) do tecido conjuntivo entre T3 e T4. Devido ao espaçamento natural entre as vértebras torácica na porção superior da coluna vertebral do rato, uma laminectomia não é necessário para revelar a medula espinhal. Esteja consciente de que muito fundo um corte irá perfurar e danificar o cabo. NOTA: Um pequeno grau de sangramento é comum durante este passo. Se isso ocorrer, mantenha uma lança esponja na área até que os subsídios sangramento (30-60 seg). Visualizar a medula espinhal. Vai ser coberto com uma espessa camada de dura-máter visível se esta camada meníngea ainda não foi cortado, mas expondo o cabo. Um vaso sanguíneo proeminente corre caudal / rostral através da linha média aproximada da medula espinhal. NOTA: Este vasculatura não deve ser usada como um ponto de referência para a linha média. Em vez disso, iluminação adequada deve revelar os limites da matéria branca e cinzenta que flanqueiam a coluna dorsal, e estes devem ser usados ​​para estimar a linha média. Se a dura-máterpermanece intacta, fazer arranhões laterais suaves com uma agulha de metal G 32 até que seja limpa. O objectivo é remover a dura-máter ao mesmo tempo que não corta as meninges subjacentes restantes, que não são tão espessa e difícil de ver. NOTA: Lançamento do líquido cefalorraquidiano indica uma violação da aracnóide e enquanto isso pode ocorrer sem danos mecânicos ao tecido, o fluido cerebrospinal acumulada deve ser removida com uma lança esponja para melhor visualizar a superfície do fio. Mover a seringa no lugar e injectando lentamente baixar até a ponta do capilar apenas mal toca na medula espinhal imediatamente lateral de cada lado da linha média. Bloqueie o braço no lugar. Use as medições graduais do braço estereotáxica direcção Z para fazer uma medição da posição da linha de base. A partir desta leitura, subtrair 1,3 milímetros. Use um movimento descendente rápida e superficial para furar o tecido e abaixe cuidadosamente o capilar até que a nova medida é atingido. Opcional: se desejado,lesões na coluna dorsal pode ser produzido pelo mesmo movimento de perfuração na linha média e uma profundidade de 0,3 mm (ver a discussão para mais informação). NOTA: Estes valores são específicos para injetar entre T3 e T4. Se optar para executar a injecção em qualquer outro local na medula espinal, estes valores têm de ser derivados a partir de qualquer atlas do cérebro do rato disponíveis. Use a micromanipulator para deprimir lisolecitina na substância branca da medula espinhal ventral. Adicione uma rotação do micromanipulador a cada 5 segundos durante 2 minutos, resultando num volume final de 0,5 mL. Deixe o capilar no local por 2 min adicionais para evitar o refluxo da solução, e em seguida, retire cuidadosamente o capilar. Amarrar um único fio de sutura no tecido muscular / adiposo que se sobrepõe à coluna vertebral. Utilize uma sutura não interrompida para fechar a pele. Aplique mais iodo para o local da incisão. Colocar o animal em uma câmara de recuperação aquecida até que se recupere, em seguida, devolvê-lo à sua gaiola. Aplicar analgésicos pós-operatório conforme a legislação de cuidados de animais institucionais. Cuidados pós-operatórios adicionais normalmente não é necessário, pois os animais são totalmente ambulatorial e capaz de auto-alimentação e beber logo que a recuperação da anestesia. Repita o procedimento para os restantes animais. NOTA: Com a proficiência, a operação pode ser concluída em 10-15 min por animal, em particular com a ajuda de uma segunda pessoa amarrando suturas. O mesmo capilar de vidro pode ser utilizado para cerca de 15-20 antes de cirurgias a ponta ficar romba e deve ser substituído. Cirurgias de controlo pode ser realizado de forma idêntica à descrita, com uma injecção de PBS na espinal-medula, em vez de lisolecitina. Nós não recomendamos a limpeza dos capilares para uso futuro. 4. Tissue Processamento e Análise Sacrificar os animais com uma overdose intraperitoneal de cetamina (500 mg / kg) e xilazina (25 mg / kg) em pontos de tempo desejados. As lesões normalmente evoluir no exerdevido maneira: 1-3 dias, desmielinização ativa; 3-7 dias, recrutamento OPC; 7-10 dias, a diferenciação oligodendrocyte; 10-21 dias, remielinização ativa 2,10,11. Para preparar o tecido para exame histológico, realizar primeiro uma perfusão transcardial com 12 20 ml de PBS temperatura ambiente seguido por 20 ml de gelo-frio paraformaldeído a 4% em PBS. Para a preparação de resina de tecido embebido para seccionamento semi- ou ultrafina, veja o passo 4.9. Remover a medula óssea utilizando uma tesoura para cortar através de curvas cada vértebras começando na extremidade cervical da coluna vertebral e trabalhando para baixo para o nível torácico inferior. Fixar as medulas espinais O / N em paraformaldeído a 4% em PBS a 4 ° C. Mudar os cabos a 30% de sacarose em PBS a 4 ° C durante pelo menos 72 horas. Identificar o local da injecção como uma anormalidade na superfície dorsal da medula espinhal. Cortar uma pe 3 mm de tecido (com o local da injecção no centro) e alinhar as peças em cryomolds contendo temperatura de corte óptima (OCT) compound. Suspender o lado de baixo dos cryomolds numa mistura gelada de 2-metilbutano e gelo seco até o OCT é completamente congelada. Armazenar a -80 ° C até estar pronto para seção. Secção medulas espinhais de um criostato com uma largura de 20 um em lâminas de microscópio e deixar secar ao ar S / N antes de armazenar as lâminas a -20 ° C. Detectar a localização da lesão e tamanho usando um eriocromo cyanine mancha histológica de mielina 13. Execute todas as etapas na RT. Lâminas de ar seco durante 30 minutos. Colocar as lâminas em agente para 1 min, seguido de re-hidratação em soluções de etanol graduadas (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, água) para limpar 1 min cada. Colocar as lâminas em solução de cianina eriocromo durante 15 min, seguido por uma lavagem de 1 minuto com água. Diferenciar em hidróxido de amónio a 0,5% durante 10 segundos, seguido de uma lavagem de 1 minuto com água. Desidratar em soluções de etanol classificados (ordem inversa, como descrito acima) durante 1 min cada, lamela com meios de montagem, e imagem em um brilhante em campo microscope. Use imunohistoquímica para visualizar os axônios e mielina. Lâminas de ar seco durante 30 minutos. Desidratar com etanol graduado (água, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%), durante 2 minutos cada à temperatura ambiente, em seguida a ordem inversa de volta à água. Este passo resulta numa maior resolução de anéis individuais de mielina 14. Bloquear interacções não específicas de anticorpos, utilizando 10% de soro de cabra e 0,25% de triton X-100 em PBS durante 60 min à temperatura ambiente. Dilui-se anticorpos primários (anticorpo de ratinho anti-SMI312 1: 2.000, de coelho anti-MBP 1: 1000) em PBS e incubar em lâminas de O / N a 4 ° C. Lavar 5 vezes durante 5 min com PBS à temperatura ambiente. Dilui-se os anticorpos secundários (Alexa 488 anti-coelho a 1: 500, Alexa 546 anti-rato a 1: 500) em PBS e incubar em lâminas durante 60 minutos à RT. Lavar 5 vezes durante 5 min com PBS à temperatura ambiente. Monte desliza com lamelas usando gelvatol e imagem num microscópio fluorescente. Use imunohistoquímica para visualizar as células da linhagem de oligodendrócitos. Siga o procedimento para step 4,7, omitindo o passo de desidratação / re-hidratação, e usando 10% de soro de cavalo, em vez de soro de cabra. Use as seguintes diluições de anticorpos primários: anticorpo de cabra anti-PDGFRα 1: 100, de ratinho anti-CC1 1: 200, de coelho anti-Olig2 1: 200. Use as seguintes diluições secundárias: Alexa 488 anti-cabra 1: 500, Alexa 594 anti-rato de 1: 500, Alexa 647 anti-coelho 1: 500. Para preparar o tecido para o corte semi- ou ultrafina, em primeiro lugar executar uma perfusão transcardial 12 com 20 ml RT PBS seguido de 20 ml gelada paraformaldeído 4% / 1% em PBS. Remover medula espinal, tal como descrito na etapa 4.3. Fix O / N em paraformaldeído a 4% / glutaraldeído a 1% em PBS a 4 ° C. Identificar o local da injecção tal como descrito no passo 4.4. Cortar um pedaço de 1 mm com tecido contendo o local de injecção. Blocos Adicionais 1 mm de cada lado da lesão pode ser preparado, bem como se desejar. Numa hotte, adicionar 10 vezes o volume de 1% de tetróxido de ósmio / 1,5% de ferrocianeto de potássio para cada bloco em gelodurante 60 min. NOTA: tetróxido de ósmio é uma substância altamente tóxica e deve ser tratado com extremo cuidado. Todos os materiais em contacto com tetróxido de ósmio deve ser colocada em óleo de milho (duas vezes o volume de solução de tetróxido de ósmio) para neutralização. Lavar os cabos 3 vezes com 0,2 M de cacodilato durante 10 min à TA, descartando em óleo de milho. Desidratar com soluções de etanol graduadas (água, 50%, 70%, 90%, 2 vezes com 95%, 2 vezes, com 100%, 2 vezes com óxido de propileno) durante 10 minutos à RT. Cabos de inserir em resina, conforme as instruções do fabricante. Cortar blocos em um ultramicrotome e montar secções em gotículas de água em lâminas de microscópio. Colocar as lâminas em uma placa quente (aproximadamente 50 ° C) até secarem. Visualize mielina, adicionando algumas gotas de 1% toluidina solução bórax / 2% para os slides para 10-15 seg a 50 ° C. Enxágüe com água, seca e lamela com media de montagem. Seções imagem em um microscópio de campo claro.