Demielinizzazione sperimentale e rimielinizzazione di Murine midollo spinale da iniezione focale Lysolecithin

NOTA: Gli animali utilizzati in questa procedura sono stati accuditi in conformità con il Consiglio canadese Animal Care (CCAC) le linee guida. Etica sono stati approvati dal Comitato dell'Università di Calgary Animal Care. 1. Preparare una siringa per iniettare Sciogliere Lysolecithin a una soluzione all'1% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; pH 7,4) e conservare a -20 ° C in piccole aliquote (75 microlitri). Scongelare una fiala di RT. NOTA: se lisolecitina è disciolto, sonicare il tubo in ultrasuoni (40 kHz) per circa 30 minuti per formare una soluzione uniforme. Maneggiare il capillare di vetro pre-tirato con estrema cautela per evitare di danneggiare la punta delicata. Svitare il dado di una siringa da 10 microlitri iniezione e infilarlo sull'estremità piatta del capillare seguito da 2 ghiere, assicurando che le estremità di accoppiamento dei puntali allineano e il capillare è aderente nella boccola conica (figura 1). Sciacquare la siringa con isopropalcool ile e rimuovere il pistone. Una volta asciutto, avvitare il gruppo ago mano stretta sulla siringa iniezione. Applicare l'ago hub metallo siringa di attivazione. Pierce un disco di gomma con l'ago e farlo scorrere fino alla base. Riempire la siringa di attivazione con lisolecitina. Deprimere delicatamente la siringa di attivazione fino a quando il liquido è visibile sulla punta dell'ago. Questo assicura bolle d'aria non saranno introdotti nella siringa iniezione. Inserire l'ago hub metallo della siringa di attivazione nella siringa iniezione. Fare una tenuta ferma con il disco di gomma, lentamente deprimere la siringa adescamento fino a quando il capillare si riempie per la punta con la soluzione. Rimuovere accuratamente la siringa di attivazione premendo contemporaneamente per riempire il cilindro della siringa iniettare senza introdurre bolle d'aria. Inserire lo stantuffo nella siringa iniezione e garantire soluzione fluisce dalla punta del capillare come lo stantuffo viene premuto delicatamente. NOTA: Se le bolle d'aria sono visibili nel tappoIllary o iniettando siringa, la preparazione siringa deve essere ripetuta dall'inizio. Fluido continuo nell'apparato iniezione è fondamentale per garantire volumi di iniezione accurati. Attaccare la siringa iniettare completato al braccio di un micromanipolatore stereotassica. Questo apparato completato sarà in grado di iniettare 15-20 animali prima di dover essere ricaricata. Eliminare il lisolecitina rimanente dalla siringa di attivazione. Ritirare e deprimere alcool isopropilico più volte, e staccare l'ago hub di metallo. Attendere alcune ore per l'alcool isopropilico rimanga nella siringa priming evapori prima di riempire di nuovo. 2. Preparare animali per la procedura chirurgica NOTA: Questa procedura è descritta per femmine C57BL / 6 topi, di età compresa tra 8-10 settimane. Anestetizzare l'animale con una iniezione intraperitoneale di ketamina (200 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) o per la cura degli animali regolamenti istituzionali. Piano per ilanimale ad essere sotto anestesia per circa 1 ora se si utilizza l'anestesia iniettabile. Prova che l'animale è profondamente anestetizzato con fermezza pizzicare il piede. Un animale adeguatamente anestetizzato non risponderà al pizzico. Utilizzando Clippers, radere un cm 2 zona 2-3 sul lato dorsale dell'animale, vicino alle orecchie. Fare attenzione a non danneggiare le orecchie. Pulire la zona pulita con il 70% di etanolo applicato ad un tampone di garza. Assicurarsi che tutti i capelli tagliati è stato rimosso dalla zona. Disinfettare la zona con iodio. Applicare vaselina per gli occhi contro l'essiccamento durante tutta la procedura. Mantenere l'animale in una camera di recupero riscaldata fino al momento di iniziare la procedura. 3. Eseguire l'intervento chirurgico NOTA: Assicurare un'adeguata tecnica asettica per tutte le fasi della procedura. Ciò include l'uso corretto dei guanti, retine per capelli, maschere e tende. Tutti gli strumenti devono essere sterilizzati prima di venire in Contact con l'animale. Spostare l'animale ad un telaio stereotassico, lato dorsale up, elevata a metà sezione per asciugamani di carta piegati esagerare la curvatura della colonna vertebrale. Fissare le braccia e la coda con nastro adesivo chirurgico e fissare la testa con un morsetto dente. Barre stabilizzatrici orecchio non sono necessari per questa procedura. Utilizzare un bisturi per fare un tre centimetri incisione mediana, iniziando appena sotto le orecchie e taglio in direzione caudale. Individuare il divario tra le 2 grandi strutture adipose e utilizzare una pinza sottile in ogni mano per tirare questi pezzi. Stendere divaricatori per aprire il campo operatorio. Sotto un microscopio operatorio, individuare il processo conseguenza di spicco della vertebra T2 (Nota: questa funzione è caratteristica del ceppo C57BL / 6 del mouse). Eseguire una dissezione smussa con forbici primavera chiusi attraverso la muscolatura sovrapposizione per visualizzare meglio T2. Utilizzando le pinze, sentire per le superfici dure di T3 e T4 per confermare il corretto posizione anatomica. Utilizzando forbici primavera, tagli laterali poco profonde (2-3 mm di profondità) del tessuto connettivo tra T3 e T4. Grazie alla distanza naturale tra vertebre nella parte toracica superiore della colonna vertebrale del mouse, una laminectomia non è necessario rivelare il midollo spinale. Essere consapevoli che troppo profondo un taglio trafiggerà e danneggiare il cavo. NOTA: Una piccolo grado di sanguinamento è comune durante questa fase. In questo caso, tenere una lancia spugna nella zona fino a quando i sussidi sanguinamento (30-60 sec). Visualizza il midollo spinale. Sarà coperto con uno spesso strato di dura visibile se questo strato meningea non è stato ancora tagliato, esponendo il cavo. Un vaso di sangue di primo piano corre caudale / rostrale attraverso la linea mediana approssimativa del midollo spinale. NOTA: Questo vascolare non deve essere utilizzato come punto di riferimento per la linea mediana. Invece, illuminazione adeguata dovrebbe rivelare i limiti della materia grigio-bianco che fiancheggiano colonna dorsale, e questi dovrebbero essere usati per stimare la linea mediana. Se la durarimane intatto, fare graffi laterali dolci con un ago di metallo G 32 fino a quando non viene cancellato. L'obiettivo è quello di rimuovere la dura, mentre non tagliare le meningi sottostanti rimanenti, che non sono così spesse e più difficile da vedere. NOTA: Rilascio di liquido cerebrospinale indica una violazione del arachnoid e mentre questo può avvenire senza danni meccanici al tessuto, liquido cerebrospinale accumulato deve essere rimosso con una lancia spugna per visualizzare meglio la superficie del cavo. Spostare la siringa per iniezione in posizione e abbassare lentamente fino alla punta del capillare appena tocca appena il midollo spinale immediatamente laterale di entrambi i lati della linea mediana. Bloccare il braccio in posizione. Utilizzare le misure graduate del braccio stereotassica direzione Z per fare una misura della posizione della linea di base. Da questa lettura, sottrarre 1,3 millimetri. Con un movimento rapido e superficiale verso il basso per perforare il tessuto e abbassare accuratamente il capillare fino al raggiungimento della nuova misurazione. Opzionale: se lo si desidera,lesioni della colonna dorsale possono essere prodotti dallo stesso movimento foratura sulla linea mediana e una profondità di 0,3 mm (vedi la discussione per ulteriori informazioni). NOTA: Questi valori sono specifici per l'iniezione tra T3 e T4. Se optando per eseguire l'iniezione in qualsiasi altro luogo nel midollo spinale, questi valori devono essere derivati ​​da qualsiasi atlante del cervello del mouse disponibili. Utilizzare il micromanipolatore per deprimere lisolecitina nella sostanza bianca del midollo spinale ventrale. Effettuare 1 rotazione del micromanipolatore ogni 5 secondi per 2 minuti, risultando in un volume finale di 0,5 ml. Lasciare il capillare sul posto per 2 minuti supplementari per impedire il riflusso di soluzione, e poi rimuovere con attenzione il capillare. Legare un singolo sutura nel tessuto muscolare / adiposo sovrapponendo la colonna vertebrale. Utilizzare una sutura non interrotta per chiudere la pelle. Applicare più di iodio al sito di incisione. Posto l'animale in una camera di recupero Scaldare fino recupera, per poi tornare alla sua gabbia. Applicare analgesici post-operativamente secondo le norme per la cura degli animali istituzionali. Ulteriori cure post-operatorie di solito non è necessaria in quanto gli animali sono completamente ambulatoriale e in grado di auto-alimentazione e il bere non appena il recupero dall'anestesia. Ripetere la procedura per gli altri animali. NOTA: Con competenza, l'operazione può essere completato in 10-15 min per animale, in particolare con l'aiuto di una seconda persona legatura suture. Lo stesso capillare di vetro può essere utilizzato per circa 15-20 ambulatori prima della punta diventa smussata e deve essere sostituito. Ambulatori di controllo possono essere eseguite in modo identico come descritto, con una iniezione di PBS nel midollo spinale anziché lisolecitina. Si sconsiglia la pulizia dei capillari per un uso futuro. 4. Tissue Processing and Analysis Sacrificio degli animali con una overdose intraperitoneale di ketamina (500 mg / kg) e xilazina (25 mg / kg) in punti di tempo desiderati. Le lesioni di solito si evolvono nel follmaniera causa: 1-3 giorni, demielinizzazione attiva; 3-7 giorni, OPC reclutamento; 7-10 giorni, la differenziazione degli oligodendrociti; 10-21 giorni, rimielinizzazione attiva 2,10,11. Per preparare il tessuto per l'esame istologico, prima eseguire una perfusione transcardial 12 con 20 ml di RT PBS seguita da 20 ml ghiacciata 4% paraformaldeide in PBS. Per la preparazione di resina tessuto embedded per sezionamento semi o ultrasottili, vedere il punto 4.9. Rimuovere il midollo spinale con le forbici osso curve per tagliare attraverso ogni vertebre partire dalla fine cervicale della colonna vertebrale e lavorando al livello toracica inferiore. Fissare i midolli spinali O / N a 4% paraformaldeide in PBS a 4 ° C. Passare i cavi al 30% di saccarosio in PBS a 4 ° C per almeno 72 ore. Identificare il sito di iniezione come una anomalia sulla superficie dorsale del midollo spinale. Tagliare un pezzo 3 millimetri di tessuto (con il sito di iniezione al centro) e allineare i pezzi in cryomolds contenenti temperatura ottimale di taglio (OCT) compound. Sospendere parte inferiore delle cryomolds in una miscela raffreddata di 2-metilbutano e ghiaccio secco fino PTOM è completamente congelato. Conservare a -80 ° C fino al momento di sezione. Sezione midollo spinale su un criostato ad una larghezza di 20 micron su vetrini da microscopio e lasciare asciugare O / N prima di riporre i vetrini a -20 ° C. Rileva posizione della lesione e le dimensioni utilizzando un eriocromo cianinico macchia istologica della mielina 13. Eseguire tutti i passaggi a RT. Diapositive asciugare per 30 min. Collocare i vetrini in agente per 1 min seguito da reidratazione in soluzioni graduate etanolo (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, acqua) compensazione per 1 min ciascuna. Collocare i vetrini in eriocromo soluzione Cyanine per 15 minuti, seguita da un 1 min di lavaggio con acqua. Differenziare in idrossido di ammonio 0,5% per 10 sec, seguito da un 1 min lavata con acqua. Disidratare in soluzioni di etanolo graduate (ordine inverso come descritto sopra) per 1 min ciascuna, coprioggetto con mezzo di montaggio, e l'immagine su un luminoso mi-campocroscope. Utilizzare immunoistochimica per visualizzare assoni e mielina. Diapositive asciugare per 30 min. Disidratare con etanolo graduata (acqua, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) per 2 min a ciascuna RT, allora ordine inverso nuovo in acqua. Questo passaggio si traduce in una maggiore risoluzione dei singoli anelli mielina 14. Bloccare interazioni anticorpo non-specifici utilizzando siero di capra 10% e lo 0,25% triton X-100 in PBS per 60 minuti a RT. Diluire gli anticorpi primari (topo anti-SMI312 1: 2.000, coniglio anti-MBP 1: 1.000) in PBS e incubare su vetrini O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte per 5 min con PBS a RT. Diluire anticorpi secondari (Alexa 488 anti-coniglio 1: 500, Alexa 546 anti-topo 1: 500) in PBS e incubare su vetrini per 60 minuti a temperatura ambiente. Lavare 5 volte per 5 min con PBS a RT. Montare i vetrini con copri-oggetto usando gelvatol e immagine su un microscopio a fluorescenza. Utilizzare immunoistochimica per visualizzare cellule della linea oligodendrociti. Seguire la procedura per step 4.7, omettendo la fase di disidratazione / reidratazione, e l'utilizzo di siero di cavallo del 10% invece del siero di capra. Utilizzare i seguenti diluizioni di anticorpi primari: capra anti-PDGFRα 1: 100, mouse anti-CC1 1: 200, coniglio anti-Olig2 1: 200. Utilizzare i seguenti diluizioni degli anticorpi secondari: Alexa 488 anti-capra 1: 500, Alexa 594 anti-topo 1: 500, Alexa 647 anti-coniglio 1: 500. Per preparare il tessuto per sezionamento parzialmente o ultrasottile, prima eseguire una perfusione transcardial 12 con 20 ml RT PBS seguiti da 20 ml ghiacciata 4% paraformaldeide / 1% glutaraldeide in PBS. Rimuovere midollo spinale come descritto al punto 4.3. Fix O / N a 4% paraformaldeide / 1% glutaraldeide in PBS a 4 ° C. Identificare il sito di iniezione come descritto al punto 4.4. Tagliare un pezzo 1 millimetro di tessuto che contiene il sito di iniezione. Ulteriori 1 millimetro blocchi su entrambi i lati della lesione possono essere preparati e se desiderato. In una cappa aspirante, aggiungere 10 volte il volume 1% tetrossido di osmio / ferrocianuro di potassio 1,5% per ogni blocco su ghiaccioper 60 min. NOTA: tetrossido di osmio è una sostanza altamente tossica e deve essere maneggiato con estrema cura. Tutti i materiali a contatto con tetrossido di osmio siano messi in olio di mais (due volte il volume come soluzione di osmio tetrossido) per la neutralizzazione. Lavare cavi 3 volte con 0,2 M cacodilato per 10 minuti a RT, scartando in olio di mais. Disidratare con etanolo soluzioni graduate (acqua, 50%, 70%, 90%, 2 volte con 95%, 2 volte con 100%, 2 volte con ossido di propilene) per 10 minuti a RT. Cavi Incorpora in resina come da istruzioni del produttore. Tagliare i blocchi su un ultramicrotomo e montare le sezioni sul gocce d'acqua su vetrini da microscopio. Collocare i vetrini su una piastra calda (circa 50 ° C) fino a secco. Visualizza mielina aggiungendo qualche goccia di 1% blu di toluidina soluzione di borace / 2% sui vetrini per 10-15 secondi a 50 ° C. Risciacquare con acqua, secchi, e coprioggetto con supporti di montaggio. Sezioni di immagine su un microscopio in campo chiaro.