实验脱髓鞘和小鼠脊髓髓鞘再生由溶血卵磷脂的焦点注射

注：在此过程中使用的动物按照加拿大议会动物护理（CCAC）的指导方针照顾。伦理学批准了卡尔加里大学的动物护理委员会。 1.准备注射器注射溶解溶血卵磷脂至在磷酸盐缓冲盐水的1％溶液（PBS; pH 7.4）中并储存在-20℃以小等分试样（75微升）。解冻一小瓶至RT。 注意：如果溶血卵磷脂是未溶解，超声处理所述管中的超声波清洗器（40千赫）约30分钟，形成均匀的溶液。 处理好与格外小心预拉玻璃毛细管，以避免损坏细腻技巧。旋10微升注入注射器的螺母和螺纹它在毛细管后跟2套圈的平坦端，确保套圈的配合端部对齐和毛细是紧贴在锥形管头（ 图1）。冲洗isoprop注射器基酒精和取出活塞。一旦干燥，紧绷螺丝针组件手到注射针筒。 首先将金属毂针起动注射器。皮尔斯的橡胶盘与针和向下滑动到基座上。填写吸注射器溶血卵磷脂。轻踏吸注射器直至液体是在针的尖端可见。这确保气泡不会被引入到注入注射器。 插入起动注射器的金属毂针头插入注入注射器。做一个坚定的密封，橡胶盘，慢慢地踩下吸式注射器，直到毛细管填充与解决方案的提示。小心地取出吸注射器同时按下填充注射针筒的筒体而不引入气泡。将活塞插入所述注入注射器，并确保从毛细管的前端溶液流动，柱塞被轻轻按下。 注：如果有任何气泡在帽可见illary或注入注射器，该注射器制剂必须重复从开头。在注射仪器连续流体对于确保精确注射量。 安装完成注入注射器立体定向显微的手臂。这样就完成设备将能够无需重新填充之前注入15-20只动物。 丢弃的注射器吸剩下的溶血卵磷脂。撤回并踩下异丙醇几次，拆下金属毂针。等待几个小时为剩余的异丙醇，在吸注射器填充之前再次蒸发。 2.准备动物的手术过程注：此过程被描述为女性C57BL / 6小鼠，8-10周龄。 麻醉动物用腹膜内注射氯胺酮（200毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克）或每机构动物护理法规。该计划动物如果使用注射麻醉是在麻醉下进行约1小时。 测试动物深受牢牢捏脚麻醉。经过适当麻醉动物不会回应的压力。 使用快船，刮胡子的动物，靠近耳朵的背侧一个2-3厘米的2区。要小心，不要损坏耳朵。 擦拭区域的清洁与加到纱布垫70％的乙醇。确保所有修剪头发已经从该地区被删除。消毒用碘的区域。 适用凡士林眼睛，以防止整个过程中干燥。 保持动物在加热的回收室，直到准备开始的过程。 3.执行手术过程注：确保所有步骤的程序足够的无菌技术。这包括正确使用手套，头饰，面具，和窗帘的。所有工具应该进来之前联系消毒吨与动物。 移动的动物到立体定位框架，背侧，升高在中间由折叠的纸巾部分夸大脊柱的曲率。固定手臂和尾部与手术胶带和固定头牙钳。稳定耳棒是没有必要的此过程。 用手术刀做一个3厘米中线切口，开始仅低于耳朵和切割在尾方向。 找到2个大的脂肪结构之间的鸿沟，并用细镊子双手各拉这些分开。传播拉钩打开手术区域。 在手术显微镜，找到T2椎体的突出生长过程（注：此功能是C57BL / 6小鼠品系的特征）。通过叠加肌肉组织进行钝性分离封闭弹簧剪刀，以更好地可视化T2。使用镊子，感觉T3和T4的硬表面，以确认正确的解剖位置。 使用弹簧剪刀，使T3和T4之间的结缔组织浅侧向切口（2-3毫米深）。由于在小鼠脊柱的上部胸椎部的椎骨之间的自然间距中，椎板切除术是没有必要的，揭示脊髓。要留意的太深削减刺破和损坏电源线。 注：在这一步小程度的出血是常见的。如果发生这种情况，保持海绵矛入区域，直到出血消退（30-60秒）。 可视化的脊髓。它将覆盖着厚厚的一层硬膜可见，如果还没有削减这脑膜层而露出电源线。一个突出的血管运行尾/喙通过脊髓的大致中线。 注：此血管不应该被用来作为一个具有里程碑意义的中线。相反，适当的照明应显示灰度白质边界侧翼的背柱，这些应该被用来估计中线。 如果硬脑膜保持不变，让温柔的侧面擦伤了32克的金属针，直到它被清除。目标是去除硬脑膜而不是切割剩余底层脑膜，这是不一样厚，更难看到。 注：脑脊液推出表示违反蛛网膜的，虽然这可能会发生没有机械损坏的组织，累积脑脊液应用海绵矛被移除以更好地可视化电源线的表面上。 移动注入注射器到位并慢慢降低，直到毛细管的尖端刚好触及脊髓立即横向中线的任一侧。锁定到位的手臂。 使用Z方向立体定向臂的分级测量作出基线位置测量。从这个读数，减去1.3毫米。使用快速而浅的向下运动刺穿组织，然后小心地将毛细管，直到新的测量为止。可选：如果需要的话，病变在背柱可通过在中线同一穿孔动作和0.3毫米（更多信息参见讨论）的深度来制造。 注意：这些值是特定的T3和T4之间的注射。如果选择加入到在脊髓的任何其它位置进行注射时，这些值必须来自任何可用小鼠脑图谱。 使用显微压低溶血卵磷脂进入脊髓腹侧白质。使1旋转微操作的每5秒，2分钟，得到在0.5微升的最终体积。留在原地的毛细管2额外分钟，以防止液回流，然后小心地取出毛细管。 配合单一缝合肌肉/脂肪组织覆盖脊柱。使用非间断缝合关闭皮肤。应用更多碘切口部位。 将动物在加热的恢复室，直到它恢复，然后将其放回笼子。应用止痛药后操作上按机构照顾动物的规定。额外的术后护理通常不是必要的，因为动物是完全动态，并能自我喂食和饮水，尽快为他们从麻醉中恢复。 重复该过程其余的动物。 注：使用熟练，操作上可以在每个动物的10-​​15分钟内完成，特别是第二个人收紧的缝合线的帮助。相同的玻璃毛细管，可用于约15-20手术前尖变钝，应予以替换。如所述的，用注射的PBS进入脊髓，代替溶血卵磷脂控制手术可以相同进行。我们建议不要在清洁毛细管供将来使用。 4.组织处理和分析牺牲动物用氯胺酮（500毫克/千克）和赛拉嗪（25毫克/千克）在所希望的时间点腹膜内过量。病变通常发展在FOLL由于方式：1-3天，积极脱髓鞘; 3-7天，OPC招聘; 7-10天，少突胶质细胞分化; 10-21日，活动髓鞘再生2,10,11。 为了制备组织用于组织学，首先执行一个穿心灌注12用20毫升室温的PBS随后在PBS20毫升冰冷的4％多聚甲醛。对于准备树脂包埋组织的半自动或超薄切片，请参阅步骤4.9。 采用弧形骨剪刀通过每个椎骨起始于脊柱的颈椎端和工作向下到较低胸椎水平切断除去脊髓。修复脊髓O / N在PBS的4％多聚甲醛在4℃。切换帘线以在PBS中的30％的蔗糖在4℃下至少72小时。 确定注射部位作为对脊髓的背侧表面的异常。切割3毫米片组织（与注射部位的中心）和对准件在含有最佳切割温度cryomolds（OCT）共mpound。暂停cryomolds的下侧中的2-甲基丁烷和干冰冷冻混合物，直到OCT是完全冻结。储存在-80°C，直到准备部分。 部上低温恒温器的脊髓在20微米的宽度到显微镜载玻片，并允许在空气中干燥O / N保存的幻灯片在-20℃之前。 检测用髓鞘13的铬花青组织学染色病灶的位置和大小。完成所有步骤，在RT。风干载玻片30分钟。地方的幻灯片中的每个1分钟清除剂为1分钟，随后再水化在梯度乙醇溶液（100％，95％，90％，70％，50％，水）。 地方的幻灯片在15分钟羊毛铬花青溶液中，然后用1分钟的洗涤用水。区分在0.5％氢氧化铵，持续10秒，随后是1分钟洗涤用水。在脱水梯度乙醇解决方案，持续1分钟每个，盖玻片与安装介质，并且图像明亮场英里（如上所述反序）croscope。 用免疫组化可视化轴突和髓鞘。风干载玻片30分钟。脱水用在RT梯度乙醇（水，50％，70％，90％，95％，100％）为每2分钟，再反向顺序返回到水中。这一步会导致个别髓鞘环14更大的分辨率。 方框，用10％山羊血清和0.25％的Triton X-100的PBS在RT下60分钟的非特异性抗体的相互作用。在PBS中孵育载玻片上O / N在4℃下稀释的初级抗体（1,000小鼠抗SMI312 1：2000，兔抗MBP 1）。 为5分钟，用PBS于室温洗5次。在PBS中孵育载玻片上，在室温60分钟稀释的二抗（500的Alexa 488抗兔1：500，Alexa的546抗小鼠1）。为5分钟，用PBS于室温洗5次。摩滑动使用GELVATOL和图像上的荧光显微镜盖玻片。 用免疫组化可视化的少突胶质细胞谱系的细胞。遵循ST程序EP 4.7，省略脱水/再水化工序中，并用10％马血清代替山羊血清。使用下列一抗稀释液：山羊抗PDGFRα1:100，小鼠抗CC1 1：200，兔抗OLIG2 1：200。使用下面的二级抗体稀释度：Alexa的488抗山羊1：500，Alexa的594抗小鼠1：500，Alexa的647抗兔1：500。 为了制备组织为半或超薄切片，首先执行一个穿心灌注12用20毫升室温的PBS，随后20毫升冰冷的4％多聚甲醛/ 1％在PBS中的戊二醛。按照步骤4.3中所述取出脊髓。修复O / N在4％多聚甲醛的PBS / 1％的戊二醛在4℃。 确定注射部位如在步骤4.4中所述。切1mm的片含有注射部位的组织。对病变的任一侧附加1毫米块如果需要，可以制备为好。 在通风橱中，加入10倍体积的1％的四氧化锇/ 1.5％亚铁氰化钾到在冰上的每个块60分钟。 注：四氧化锇是一种剧毒物质，应格外小心。在用四氧化锇接触的所有材料应置于玉米油（两倍体积为四氧化锇溶液）进行中和。 用0.2M二甲胂酸盐洗帘线3次在室温10分钟，在玉米油丢弃。脱水用梯度乙醇溶液（水，50％，70％，90％，2倍，95％，2倍，100％，2倍与氧化丙烯），用于在RT下10分钟。 在树脂嵌入线按照制造商的说明。 削减块对超微和安装部分到水滴在显微镜载玻片。地方上滑动的热板上（约50℃）至干。 通过在50℃下加入数滴1％甲苯胺蓝/ 2％硼砂溶液到载玻片10-15秒形象化髓鞘。用清水冲洗干净，干燥，盖玻片与安装介质。在明亮的视野显微镜的图像部分。