التجريبية إزالة الميالين وعودة الميالين من الحبل الشوكي الفئران عن طريق حقن البؤري من ليزوليسيتين
Summary
Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.
Abstract
التصلب المتعدد هو مرض المزيل للالتهابات في الجهاز العصبي المركزي التي تتميز تشكيل لوحة تحتوي قليلة التغصن المفقودة، المايلين، المحاور، والخلايا العصبية. عودة الميالين هو آلية إصلاح الذاتية حيث يتم إنتاج المايلين جديد لاحقة في الانتشار، التوظيف، وتمايز الخلايا دبقية قليلة التغصن السلائف إلى قليلة التغصن تشكيل المايلين، وضروري لحماية محاور من مزيد من الضرر. حاليا، كل العلاجات لعلاج التصلب المتعدد تستهدف المكون المناعة الشاذة لهذا المرض، والتي تقلل التهابات الانتكاسات ولكن لا تمنع التقدم إلى انخفاض العصبية لا رجعة فيه. ولذا فمن الضروري أن استراتيجيات تعزيز عودة الميالين وضعها الذي قد يؤدي إلى تأخير تطور المرض وربما عكس أعراض عصبية. عدة نماذج حيوانية من إزالة الميالين موجودة، بما في ذلك التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي وcurprizone. ومع ذلك، هناك حدها الاقصىطفرات في استخدامها لدراسة عودة الميالين. نهج أكثر قوة هو حقن البؤري من السموم في الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك ليزوليسيتين مواد التنظيف في الحبل الشوكي المادة البيضاء من القوارض. في هذا البروتوكول، ونحن تثبت أن العملية الجراحية التي ينطوي عليها عن طريق الحقن ليزوليسيتين في المادة البيضاء البطنية من الفئران هو سريعة وفعالة من حيث التكلفة، ويتطلب أي مواد إضافية من تلك المتاحة تجاريا. هذا الإجراء مهم ليس فقط لدراسة الأحداث الطبيعية التي تنطوي عليها عملية عودة الميالين، ولكن أيضا كأداة ما قبل السريرية لفحص المرشح العلاجات المعززة للعودة الميالين.
Introduction
التصلب المتعدد (MS) هو مرض مزمن المزيل للنظام العصبي المركزي (CNS) التي تتميز تسلل خلية المناعة، واللوحات التي تحتوي فقدت المايلين، قليلة التغصن، محاور والخلايا العصبية. معظم المرضى لديهم مسار المرض تتكون من الانتكاسات التهابات برفقة مجموعة واسعة من أعراض عصبية، تليها فترات من مغفرة. أكثر من نصف هؤلاء المرضى الانتقال في نهاية المطاف إلى مرحلة تقدمية الثانوية مع أي انتكاسات واضحة ولكن تراجع عصبي مستمر. ويعتقد أن هذا التدهور التدريجي بسبب الأضرار محور عصبي والخسارة، وساهمت في جزء من إزالة الميالين المزمن. وبالتالي تعتبر استراتيجيات لاستعادة المايلين المفقود نهج العلاج واعد لتأخير تطور المرض وربما عكس أعراض عصبية.
عودة الميالين هو استجابة إصلاح الذاتية في الجهاز العصبي المركزي حيث يتم إنشاؤها الأغماد المايلين جديدة من خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف تجنيدهم(يجد OPCs) التي تفرق في قليلة التغصن تشكيل المايلين. وقد تبين عودة الميالين في النماذج الحيوانية أن تكون قوية جدا 1-3، ومع ذلك، تنخفض كفاءتها مع تقدم العمر 4. في الواقع، يحدث عودة الميالين في البشر على الرغم من أنها غير مكتملة في معظم مرضى التصلب المتعدد 5. جميع الأدوية المتاحة حاليا لMS تستهدف في المقام الأول المكون المناعة الشاذة للمرض و، في حين فعالة في الحد من الانتكاسات، لا تأخير تطور المرض بشكل ملحوظ. وسيكون الجيل القادم من الاستراتيجيات العلاجية لإدارة MS دمج التقدم في تعديل مناعي مع تعزيز عودة الميالين الذاتية من أجل منع كل من الانتكاسات والتقدم 6.
طريقة واحدة لدراسة اكتئاب وعودة الميالين في الجهاز العصبي المركزي ينطوي على حقن المباشر للlysophosphatidylcholine المنظفات (ليزوليسيتين) في الحبل الشوكي المادة البيضاء 1،3،7. ينتج هذا الإجراء demyelinat تتميز أيضاإصابة تتألف أساسا من البلاعم / دبقية تسلل وتفعيل 8،9، دباق النجمي رد الفعل، اضطراب التوازن محور عصبي / إصابة محور عصبي، وانتشار OPC والهجرة 10 جي. الآفة تطور متوقع خلال فترة أسابيع قليلة، وقادر في نهاية المطاف من remyelinating بالكامل. وقد كان هذا الأسلوب مفيدا بشكل خاص في دراسة الرقص الشعبي من أحداث المشاركة في اجتثاث وعودة الميالين. وعلاوة على ذلك، فقد تم اعتماده كأداة لاختبار ما قبل السريرية من العلاجات مرشح لتسريع إصلاح التالية إهانة المزيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تطوير عدد من نماذج حيوانية لدراسة MS، الأكثر معترف بها التجريبية التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (EAE) النموذج. في EAE، وتحصين ضد القوارض جزء من الببتيد المايلين والخضوع لتطوير الآفة التهابات يظهر في شلل تصاعدي. في حين كان هذا نموذجا مفيدا للاختبار ما قبل السريري لالمناعية المخدرات MS، فإنه ليست مثالية لدراسة عودة الميالين لثلاثة أسباب رئيسية: أولا، الموقع من الآفات الالتهابية هو عشوائي إلى حد ما، وتحديد الآفات عند معالجة الأنسجة لشبه أو سامسونج يمكن أن يكون تحديا أقسام. والثاني هو أن عودة الميالين يحدث خلال دورة زمنية محددة، وبالضبط سن EAE آفة واحدة لا يمكن أن يكون معروفا دون التصوير بالرنين المغناطيسي غير الغازية المستمر. والثالث هو أن عودة الميالين هو ظاهرة تحدث بشكل طبيعي في القوارض، ودليل على عودة الميالين التالية العلاج من تعاطي المخدرات في EAE قد لا يكون نتيجة الرئيسية لهذا العقار، ولكن فيبدلا ظاهرة الثانوية للحد من الالتهابات.
ويتحقق أسلوب شائع آخر من إنتاج إزالة الميالين عن طريق إدخال النحاس خالب cuprizone في النظام الغذائي. وهذا يؤدي إلى إزالة الميالين على نطاق واسع، وعلى الأخص في الجسم الثفني. هناك قيود في دراسة الجسم الثفني كموقع للعودة الميالين للأسباب التالية: أولا، أقطار محور عصبي (وبالتالي سماكة المايلين) هي أصغر من مناطق الجهاز العصبي المركزي الأخرى، ويمكن الأغماد بالتالي remyelinated رقيقة لا يمكن تمييزها عن تلك التي لم تكن عديمة الميلين. وثانيا، لأن الثفني الماوس الإحضار يحتوي> 70٪ محاور كمون الفعل 16، يمكن أن يكون من غير الواضح ما إذا كانت شريحة remyelinated هو إصلاح الحقيقي للتلف المايلين أو دي نوفو توليف المايلين في الكبار، والذي يحدث عادة 17.
ومن إيماننا بأن أفضل نموذج لدراسة عودة الميالين هو الحقن المباشر من السموم، وإما ليزوليسيتين، ethidبروميد البوتاسيوم، أو غيرهم، في السويقتين الدماغية الذيلية 18 أو المادة البيضاء الحبل الشوكي. ويتحقق الموقع السابق إلا عن طريق الحقن الدقيق المجسم 3-البعد، ويقتصر على القوارض الكبيرة (الفئران) نظرا لصغر حجم السويقتين للدماغ. ويستثنى من هذا المورد واسعة من الفئران المعدلة وراثيا في دراسة اجتثاث وعودة الميالين. الحبل الشوكي، ومع ذلك، يحتوي على العديد من مساحات المادة البيضاء الكبيرة التي يسهل الوصول إليها جراحيا. فراغات بين الفقرات في هذا الجزء الصدري منقاري تسمح لتعرض الحبل الشوكي دون الحاجة إلى وجود الثقب، وهي خطوة ضرورية في العمليات الجراحية الصدرية الذيلية. ميزة استهداف تحديدا المادة البيضاء البطنية هي أن محاور هي أكبر موحد من المادة البيضاء ظهري، مما يجعل القياس الكمي للعودة الميالين إلى أقل غموضا-مهمة مماثلة للتحديات المرتبطة الجسم الثفني. بالإضافة إلى ذلك، المادة البيضاء بطني تشكل تي أكبر من ذلك بكثيرarget منطقة لحقن. أن عدة مئات من ميكرون أفقيا في المنطقة الظهرية تضع الشعرية خارج العمود، في حين أن نفس الانحراف سوف البطني تزال تنتج المزيل للآفة بارزة. بعض البروتوكولات حقن ليزوليسيتين في كل من ظهري وبطني الأعمدة من نفس الحيوان (19). هذا يمكن أن تزيد من احتمال وقوع التنسيب الشعرية السليم وعدد الآفات قابلة للقياس الكمي في عدد أقل من الحيوانات. في حين أن البيانات الحالية المقدمة هي بين 8-10 أسبوع الحيوانات القديمة في وقت العملية، كان لدينا أيضا نجاح باستخدام نفس الإجراء على الفئران القديمة 8-10 شهر، حيث وصفت عودة الميالين بأنها أبطأ بشكل ملحوظ 4.
الكمي للعودة الميالين ليست مهمة تافهة. والعقيدة المركزية تفترض أن قطاعات remyelinated هي أقصر في الطول وأرق في المتوسط من نظرائهم صحية، وبالتالي الحسابات ز-نسبة (قطر محور عصبي مقسوما على محور عصبي + قطر المايلين) من مستعرضة شبه سأصبحت أقسام ص سامسونج الإجراء العادي. ومع ذلك، فمن المعروف أن قطاعات remyelinated رشاقته على مر الزمن 2 و دراسة حديثة باستخدام مراسل المعدلة وراثيا من قليلة التغصن remyelinating تشير إلى أن العديد من السلاميات تصبح في نهاية المطاف تمييزه عن السيطرة 20. تحديد عدد ناضجة قليلة التغصن داخل الآفة هو وسيلة غير مباشرة لقياس إصلاح، وقليلة التغصن هي قادرة على صنع عدد كبير من السلاميات، ونسبة كبيرة من على نموذج اعتمادا عودة الميالين استخدامها يمكن أن يحدث من خلايا شوان 3. وبطبيعة الحال، كما تم ربط عودة الميالين إلى إعادة التوصيل قفزي 21، والمقياس النهائي للإصلاح سيكون الانتعاش وظيفية من العجز العصبية. في حين ارتبط عودة الميالين إلى استعادة وظيفة في بعض الأنواع 22،23، فإنه لم يصبح الإجراء القياسي في دراسات ليزوليسيتين الفئران. هذا هو الأرجح بسبب عدم وجود observ العلنيالعجز قادرة إما من الظهرية أو البطنية الآفات، مقارنة مع نماذج إزالة الميالين أكثر قوة مثل EAE وحتى cuprizone. ونحن نعتقد أن عجز وظيفي الناتجة عن ليزوليسيتين الحقن، والانتعاش لاحق مع عودة الميالين، سيكون الموثقة فقط باستخدام الاختبارات الحساسة من سير الحسية على ما يرام.
بحث في PubMed من "عودة الميالين" جنبا إلى جنب مع أي من النماذج الحيوانية المذكورة أعلاه، وإن كان الأسلوب المنهجي الفظ، ويظهر أقل يضرب البحث عن ليزوليسيتين (109) مقارنة EAE (188) وcuprizone (197). إذا حجتنا أن ليزوليسيتين إزالة الميالين هو النهج متفوقة لدراسة عودة الميالين، لماذا هو على الأقل مناقشتها؟ ربما يكون الخوف لاستخدام هذا الأسلوب مستمد من الاعتقاد الصعوبة الفنية في أداء العملية الجراحية. في واقع الأمر، وهذا الإجراء هو سريعة وفعالة من حيث التكلفة، وليس أكثر صعوبة من تشريح الأنسجة الروتينية، مما يتطلب المواد التي هي كلها commerمتوفرة cially. ويحدونا الأمل في أن هذا البروتوكول هو أمر مفيد بالنسبة لأولئك الذين يرغبون في إضافة هذا نموذج قوي لذخيرتهم لدراسة حقل مثيرة وتوسيع للإصلاح المايلين.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was funded by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada and the Alberta Innovates – Health Solutions CRIO Team program. MBK is a recipient of studentships from Alberta Innovates – Health Solutions and the Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ is funded by a graduate student support grant from the Alberta endMS Regional Research and Training Center of the Multiple Sclerosis Society of Canada. The authors wish to acknowledge Dr. Jan van Minnen and the Regeneration Unit in Neurobiology core facility for training and use of equipment.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
| clippers | Philips | QG3330 | |
| heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
| surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| scalpel blade | Feather | No. 15 | |
| sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
| curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
| 32 gauge metal needle | BD | 305106 | |
| needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
| compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μL syringe is a tighter fit |
| priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
| pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
| stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
| Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
| cryostat | Leica | CM1900 | |
| microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| bright field microscope | Olympus | BX51 | |
| ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
| Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
| Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2000 dilution |
| Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
| Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
| Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
| PBS | Oxoid | BR0014 | |
| isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
| ketamine | CDMV | ||
| xylazine | CDMV | ||
| iodine | West Penetone | 2021 | |
| Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| sucrose | Sigma | S5016 | |
| Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
| sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
| iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
| ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
| Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
| Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| horse serum | Sigma | H0146 | |
| glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
| osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
| potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
| corn oil | Sigma | C8267 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
| glycerol | Sigma | G9012 | |
| cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
| propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
| EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
| Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
| Recipes | |||
| Eriochrome cyanine solution | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
| sulfuric acid | 400 mL 0.5% | ||
| iron(III)chloride | 20 mL 10% | ||
| water | 80 mL | ||
| *add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
| Gelvatol | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| PBS | 140 mL | ||
| polyvinyl alcohol | 20 g | ||
| glycerol | 40 g | ||
| *mix well, place at 37 °C overnight, centrifuge at 1960xg 30 min, aliquot into 40 tubes |
Referencias
- Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin. J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).
- Blakemore, W. F. Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).
- Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination. Glia. 28 (1), 77-83 (1999).
- Patrikios, P., et al. Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients. Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).
- Keough, M. B., Yong, V. W. Remyelination therapy for multiple sclerosis). Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).
- Hall, S. M. The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord. J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).
- Miron, V. E., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).
- Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination. Glia. 35 (3), 202-212 (2001).
- Lau, L. W., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination. Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).
- Fancy, S. P., et al. Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS. Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Skihar, V., et al. Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).
- Plemel, J. R., et al. Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice. Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).
- Chong, S. Y., et al. Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).
- Sturrock, R. R. Myelination of the mouse corpus callosum. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 6 (6), 415-420 (1980).
- Young, K. M., et al. Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling. Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).
- Woodruff, R. H., Franklin, R. J. Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study. Glia. 25 (3), 216-228 (1999).
- Mei, F., et al. Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Powers, B. E., et al. Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).
- Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. Central remyelination restores secure conduction. Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination. Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).
