Недорогой, масштабируемая Поведенческая Анализ для измерения этанола седации Чувствительность и быстрый толерантности в<em> Drosophila</em
Summary
Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.
Abstract
Употребление алкоголя расстройства (AUD) является серьезной проблемой здравоохранения. Несмотря на большое наследственный компонент к AUD, несколько генов были однозначно вовлечены в их этиологии. Плодовая муха, дрозофилы, является мощная модель для изучения молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе поведения, связанных с алкоголем, и поэтому имеет большие перспективы для выявления и понимания функции генов, которые влияют на AUD. Использование модели Drosophila для этих типов исследований зависит от наличия анализов, которые надежно измерить поведенческих ответов на этанол. Этот отчет описывает анализ подходящий для оценки чувствительности этанола и быстрый допуск в мух. Чувствительность Этанол измеряется в данном исследовании зависит от объема и концентрации этанола, используемого, разнообразие сообщалось ранее генетических манипуляций, а также время, в течение мухи размещены без пищи непосредственно перед тестированием. В отличие от этого, этанола сensitivity измеряется в этом анализе не зависит от энергичности обработки зольной, пола мух и добавок в ростовой среде с антибиотиками или живых дрожжей. Три различные методы количественного чувствительности этанола описаны, все это ведет к существенно неразличимые результаты чувствительности этанола. Масштабируемая природа этого анализа, в сочетании с его общей простоты в настройке и относительно низкий расход, сделать его пригодным для малых и крупных генетического анализа чувствительности этанола и быстрого толерантности у дрозофилы.
Introduction
Употребление алкоголя расстройства (AUD) является огромной проблемой здравоохранения во всем мире (обзор в 1). Хотя механизмы приводные развитие AUD сложны, эти расстройства имеют большое генетический компонент (например, 2). Большой наследуемость AUD и консервативных поведенческих реакций на этанол во многих видов (рассмотренных в 3,4), породили сильный интерес к использованию генетических модельных организмов проверки причастности конкретных генов в этаноле, связанных с поведением по отношению к лучшему пониманию молекулярных основ AUD. Плодовая муха, дрозофилы, стала ведущей моделью организма для изучения молекулярно-генетических механизмов этанола, связанных с поведением (обзор в 3,4). Исследования, проведенные в мух подчеркнули роль для нескольких сигнальных путей в поведенческих ответов на этаноле (обзор в 5). Интересно, что некоторые из генов и путей, которые влияют на поведенческие RESPONSES в этаноле в мух также вовлечены в грызунов этанола, связанных с поведением и / или человеческого AUD (например, 6-14). Сохранение механизмов вождения этанола, связанных с поведением разных видов, в сочетании с набором генетических инструментов, доступных в модельной системе Drosophila, подчеркивают полезность лету модели с фруктами для исследования генетики поведенческих реакций в этанол.
Чувствительность 15,16 и толерантность (обзор в 17) к этанолу в организме человека связана с развитием AUD. Оба этих поведенческих реакций в этаноле могут быть смоделированы в мух с помощью различных лабораторных анализов (обзор в 3,4). Все лету анализов, известных авторов основаны либо на зависимости от времени этанола, вызванных седации / несогласованность или зависящих от времени восстановления из этанола седации.
В предыдущей статье из нашей группы по генетике чувствительности этанола и гДопуск APID у дрозофилы, был использован поведенческий тест на основе паров этанола, вызванных седации мух 18. Испытание в этом тесте была инициирована передачей живой взрослых мух без анестезии, чтобы очистить пищевых флаконы, захвата мух в пузырьках с ацетата целлюлозы пробки, добавлением этанола к началу (т.е. не муха сторона) ацетата целлюлозы вилки и уплотнения флакона мух, ацетата целлюлозы вилку и этанола с силиконовой пробкой (см схематический рисунок S3, ссылка 18). Несколько флаконов, представляющих различные группы мух оценивали параллельно, увеличивая пропускную способность этого анализа. Флаконы были даны анонимный код и экспериментаторы не знали о группе лечения, чтобы предотвратить непреднамеренное смещение в оценке седативного эффекта. В стандартном эксперименте, летит в флаконах прослушивались мягко 6-минутными интервалами, и после восстановления 30 сек, количество седативных мух в каждом флаконе подсчитывали и Converted к процентному активных мух. Мухи поглощается парами этанола из ацетата целлюлозы вилкой в зависимости от времени образом, в результате чего прогрессивное увеличение внутреннего этанола 18 и седации (CF задание 18 и Рисунок 1A и 1B в настоящем докладе). Торможение в данном анализе была функционально определяется как мух (I) положении при отсутствии ходьба или (II), лежа на спине с или без хлопая крыльями. Вот это этанол седативный анализ описан в деталях, в дальнейшем Оперативная Оптимизация отношение к его использованию обеспечивается, и анализ используют для решения вклад опций пищевых добавок на чувствительность муха седации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Прямые анализы, что воспроизводимо количественно значимых фенотипов имеют большое значение для анализа поведения. Работа, описанная здесь рассматривается ряд практических аспектов в анализе для измерения чувствительности этанол седации и быстрый допуск у дрозофилы. Хотя это и ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were supported by grants from the National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse to M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). The authors thank Jill Bettinger for helpful discussions and Jacqueline DeLoyht for technical assistance.
Materials
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
Referencias
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A., Reilly, M. T., Lovinger, D. M. . Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. 91, (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genética. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Rothenfluh, A., Troutwine, B. R., Ghezzi, A., Atkinson, N. S., Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
