ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים
Summary
We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.
Abstract
Electroretinogram (ERG) הוא שיטה לא פולשנית אלקטרו לקביעת תפקוד רשתית. באמצעות המיקום של האלקטרודה על פני השטח של הקרנית, פעילות חשמלית שנוצרה בתגובה לאור ניתן למדוד ומשמש להערכת הפעילות של תאים ברשתית in vivo. כתב יד זה מתאר את השימוש של ERG למדוד תפקוד ראייה של דג הזברה. דג הזברה ארוכה כבר נוצל כמודל לפיתוח חוליות בשל הקלות של דיכוי גן על ידי oligonucleotides morpholino ומניפולציה תרופתית. ב5-10 DPF, רק קונוסים הם פונקציונליים ברשתית הזחל. לכן, דג הזברה, בניגוד לבעלי חיים אחרים, היא מערכת מודל עוצמה לחקר תפקוד הראייה קונוס in vivo. פרוטוקול זה משתמש הרדמה סטנדרטית, מיקרומניפולציה ופרוטוקולי stereomicroscopy כי הם נפוצים במעבדות המבצעות מחקר דג הזברה. שיטות שתוארו לעשות שימוש בEQ אלקטרופיזיולוגיה הסטנדרטיuipment ומצלמה אור נמוך כדי להנחות את המיקום של microelectrode ההקלטה על גבי קרנית הזחל. לבסוף, אנו מדגימים כיצד ממריץ / מקליט ERG זמין מסחרי שנועד במקור לשימוש עם עכברים יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם דג הזברה. ERG של דג הזברה זחל מספק שיטה מצוינת שלו מנסה לאמוד פונקציה חזותית חרוט בבעלי חיים ששונו על ידי הזרקת oligonucleotide morpholino כמו גם בשיטות של הנדסה גנטית חדשות יותר כגון אצבע nucleases (ZFNs) האבץ, תמלול Activator-כמו מפעיל nucleases (TALENs), ו חזרות התקבצו באופן קבוע Interspaced הקצר Palindromic (CRISPR) / Cas9, אשר כולם בצורה ניכרת את היעילות והיעילות של גן המיקוד בדג זברה. בנוסף, אנו מנצלים את היכולת של סוכנים תרופתיים לחדור זחלי דג הזברה להעריך את המרכיבים המולקולריים התורמים לphotoresponse. פרוטוקול זה מתאר התקנה שיכולה להיות משונית ושימוש על ידי חוקריםעם מטרות ניסוי שונות.
Introduction
Electroretinogram (ERG) הוא שיטה לא פולשנית אלקטרו שכבר נעשה שימוש נרחב במרפאת לקביעת התפקוד של הרשתית בבני אדם. הפעילות החשמלית בתגובה לגירוי אור נמדדת על ידי הנחת אלקטרודות הקלטה על פני השטח החיצוניים של הקרנית. המאפיינים של הפרדיגמה הגירוי וצורת גל התגובה להגדיר את תאי העצב ברשתית תורמים לתגובה. שיטה זו הותאמה לשימוש עם מספר המודלים של בעלי חיים, כולל עכברים ודג זברה. יש תגובת ERG חוליות הטיפוסית ארבעה מרכיבים עיקריים: א-גל, שהוא פוטנציאל קרנית-שלילית הנגזר מפעילות תאי קולטי אור; ב-הגל, פוטנציאל קרנית-חיובית הנגזר מON תאים דו קוטביים; ד-הגל, פוטנציאל קרנית-חיובית להתפרש כפעילות של התאים דו קוטביים OFF; וג-הגל, אשר מתרחש כמה שניות לאחר b-הגל ומשקף פעילות בגליה מולר והמילאפיתל הפיגמנט INAL 1-4. אזכור נוסף להבנת ההיסטוריה והעקרונות של ניתוח ERG בבני אדם ובעלי חיים מודל הוא ספר הלימוד המקוון, Webvision, מאוניברסיטת יוטה וטקסטים כגון עקרונות ותרגול של אלקטרופיזיולוגיה הקלינית של 4 Vision, 5.
rerio Danio (דג הזברה) כבר העדיף ארוך כמודל לפיתוח חוליות, בשל ההבשלה המהירה שלה ושקיפות, אשר מאפשרת ניתוח לא חודרני המורפולוגי של מערכות איברים, מבחני התנהגות והן קדימה לאחור מסכי גנטיים (לסקירה, ראה Fadool ו דאולינג 6). זחלי דג הזברה הם נוחים מאוד למניפולציה גנטית ותרופתית, אשר, כאשר יחד עם הפוריות הגבוהה שלהם, לגרום להם מודל חיה מצוין לניתוחים ביולוגיים תפוקה גבוהה. היחס גבוה יותר של קונוסים למוטות בדג הזברה זחל – בערך 1: 1 בהשוואה לעכברים (~ קונוס 3%ים) – להפוך אותם שימושי במיוחד ללימוד הפונקציה חרוט 7-9.
ברשתית החוליות, קונוסים לפתח לפני מוטות 10. מעניין, קונוסים דג הזברה הם אופרטיביים מוקדם ככל 4 DPF, המאפשרים ניתוח אלקטרו סלקטיבית של קונוסים בשלב זה 6, 11,12. בניגוד לכך, תגובות ERG במוטות מופיעות בין 11 ל 21 DPF 13. לכן, זחלי דג הזברה ב4-7 DPF לשרת תפקודי כרשתית כל-קונוס. עם זאת, תגובת ERG photopic יליד 4-7 זחלי DPF נשלט על ידי b-הגל. יישום של סוכנים תרופתיים, כגון L – (+) – 2-אמינו-4-phosphono-butyric חומצה (L-AP4), אגוניסט לגלוטמט metabotropic קולט (mGluR6) בא לידי ביטוי בON תאים דו קוטביים, חוסם ביעילות את הדור של ב-הגל ומגלה את הפוטנציאל המבודד ההמוני קונוס קולט, ("גל") 14-17.
כאן אנו מתארים פשוטים וreliablשיטת דואר לניתוח ERG באמצעות ציוד ERG זמין מסחרי מיועד לשימוש עם עכברים שהותאמו לשימוש עם זחלי דג הזברה. מערכת זו יכולה להיות מנוצלת על זחלי דג הזברה של משתנה רקע גנטי, כמו גם אלו שטופלו בסוכנים תרופתיים, כדי לסייע לחוקרים בזיהוי של מסלולי איתות שתורמים לרגישות חזותית והסתגלות אור 16. הפרוצדורות מפורטות בפרוטוקול זה תדריך את החוקרים בשימוש בניתוח ERG כדי לענות על מגוון של שאלות ביולוגיות הנוגעות לראייה, ומדגימות את הבנייה של התקנת ERG גמישה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה הליך פשוט להקלטות ERG של דג הזברה זחל מפורט. הליך זה מאפשר לassay מהיר והמקיף של function.There החזותי מספר שלבים קריטיים בכל ההליך שצריך להיות כל הזמן בראש. זחלי דג הזברה צריכים להיות בריאים לפני הניסוי למניעת מוות בטיפולים תרופתיים פוטנציאליים ולהבטיח פרנסה ממוש…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| Faraday cage | 80/20 Inc | custom | Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework |
| PVA sponge | Amazon | B000ZOWG1C | Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae |
| 150 ml Sterile Filter systems | Corning | 431154 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | Holding and positioning the recording microelectrode |
| Magnetic ring stand | Drummond | 3-000-025-MB | Holding and positioning of the camera and refrence electrode |
| Lead extensions | Grass Technologies | F-LX | Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes |
| Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor | Grass Technologies | DF-215/10 | Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins |
| Window screen frame (metal) and spline | Lowes or Home Depot | various | For attaching copper mesh to Faraday cage framework |
| Steriflip 50 ml filters | Millipore | SCGP00525 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| BNC adaptor | Monoprice | 4127 | Connecting camera to BNC cable |
| BNC cable | Monoprice | 626 | Connecting camera to video adaptor |
| Camera lens | Navitar | 1582232 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Camera coupler | Navitar | 1501149 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Luna BNC to VGA + HDMI Converter | Sewell | SW-29297-PRO | BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor |
| APB | Sigma | A1910 | mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential |
| Borosilicate glass | Sutter | BF-150-86-10 | Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) |
| P97 Flaming/Brown puller | Sutter | P97 | For pulling glass micropipettes |
| Sorbothane sheet | Thorlabs | SB12A | Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size |
| Breadboard | Thorlabs | B2436F | Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen |
| Passive Isolation Mounts | Thorlabs | PWA074 | Provides vibration isolation to breadboard |
| Copper mesh | TWP | 022X022C0150W36T | To line Faraday Cage |
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae |
| Pasteur pipettes | VWR | 14672-608 | Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae |
| Camera | Watec | WAT-902B | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Tricaine (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Pharmaceutical-grade anesthetic, |
| Micro-fil | WPI | MF28G-5 | Filling microelectrode holder and microelectrode glass |
| Microelectrode holder | WPI | MEH2SW15 | Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment |
| Reference Electrode | WPI | DRIREF-5SH | Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode |
| Reference Electrode (alternative) | WPI | EP1 | Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead |
| Low-noise cable for Microelectrode holder | WPI | 13620 | Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard |
Referencias
- Dowling, J. E. . The retina: an approachable part of the brain. , (1987).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Perlman, I., Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
- Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
- Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
- Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
- Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
- Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
- Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
- Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
- Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , (2007).
- Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
- Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
- Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
- Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).
