תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון
Summary
This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.
Abstract
Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.
Introduction
סוגי I ו- III אינטרפרונים (IFN) הם קריטיים בתגובה החיסונית לוירוסים וגירויים פתוגניים אחרים ובהווה בכל החוליות 1. תאי מערכת חיסון ואינו חסינים להביע ולהפריש, כמו גם להגיב ל, IFN 2. חיישני חיסון מולדים, כגון קולטנים לחיוג כמו (TLR), סטינג, וRIG-אני, לגרום לי סוג וביטוי III IFN על זיהוי של דפוסי הפתוגן קשורים מולקולריים (PAMP) 3,4. בבני אדם, סוג אני IFN כולל IFN-β, -ω, -κ, ו -12 תת-סוגים של IFN-α, ונקשר לרצפטור IFNAR1 / IFNAR2 המורכב 2,5. סוג III IFN כולל IFN-λ1, -λ2, ו-λ3 ולהיקשר לקולטן המורכב IL10RB / IL28RA 2. קלסי, סוגי I ו- III IFN נקשרים לקולטן מתחמים המיוחסים להם שלאחר מכן לגייס STAT1 / heterodimers STAT2 וליזום שעתוק של גני אינטרפרון מגורה (ISG) 6. ISG מעורב במגוון הרחב של פונקציות, מנגיפים ואנטיפעילות שגשוג להפעלה של התגובה החיסונית אדפטיבית 7.
מנגנונים הרבים פתוגנים התפתחו כדי להתחמק, לערער, ולחטוף את האלמנטים של מסלול איתות IFN להדגים את החשיבות של IFN בתגובה החיסונית המולדת 8. לדוגמא, וירוס vaccinia מבטא קולט דמה עם ההומולוגיה IFNAR1 שsequesters הקלד אני IFN 9 בעוד וירוס מחלה דמוי Yaba מפריש גליקופרוטאין שמעכב הקלד I ו- III IFN חלבונים 10. בנוסף לתפקידם בהגנת מארחת, IFN גם מעורב במעקב הסרטן ומספר מחלות אוטו-דלקתי: השתקת ביטוי IFN בתאי סרטן השד מגבילה immunosurveillance 11, ייצור יתר של IFN-α הוא מנגנון בפיתוח מערכתי זאבת אדמנתית 12, והפעלה תועה של סטינג מובילים לדלקת מערכתית הנגרמת על ידי כמויות עודפות של IFN בvasculopathy הקשורים STING13. טיפולי, IFN משמש לטיפול בטרשת נפוצה 14, זיהומים נגיפיים כרוניים כגון 15 HBV ו- HCV 16,17, וסוגי סרטן כמו לוקמיה שעיר תא 18 ולוקמיה מיאלואידית כרונית 19. שאלות על הרלוונטיות של IFN בתהליך פיסיולוגי מסוים ברציפות לחשוף את הטבע בכל מקום של משפחת ציטוקינים זה.
הקלד אני IFN, במיוחד תת IFN-α, נחשב לעתים קרובות כישות אחת 20-23, ולא כקבוצה קשורה באופן הדוק, אך ברורה, חלבונים. הקיום וההתמדה של מיני IFN המרובים כולל תת IFN-α, לאורך האבולוציה חוליות 24 מצביעים על כך שלפחות קבוצת משנה של תת אלה יש פונקציות ספציפיות או ייחודיות. ייתכן שדפוסי ביטוי IFN הגדרה יהיו לפענח ולעזור לאפיין את הפונקציות הספציפיות של אחד או יותר מתת 17. האתגר של לימוד tהוא מקליד תת I ו- III IFN מבוסס על זהות הרצף המשותפת שלהם: שנים עשר תתי הסוגים IFN-α לשתף> 50% 25 ותת IFN-λ לשתף 81-96% 26 של רצפי חומצות אמינו שלהם. בassay qRT-PCR שתואר, משואה מולקולרית (MB) וחומצות גרעין נעולות (LNA) בדיקות ניאון להפלות הבדלי זוג בסיס יחידים בין הרצפים תת סוג IFN דומים מאוד ומאפשרים האפיון של חתימת ביטוי IFN. פורמט הצלחת 384 גם של assay כולל שני (סטנדרטים פרוטוקול) כמותי ו( גני משק הבית (HKG)) חצי כמותית אמצעים, המאפשר ניתוח על ידי עותק תמליל מספר וΔCq בהתאמה. הרכבה אצווה, בהנחייתם של pipetting אוטומטית רבת ערוצים, ואחסון לטווח ארוך, אפשרית באמצעות ייבוש פריימר / הבדיקה (Pr / Pb) קובעת על הצלחות, לשפר את שחזור, שירות, והמעשיות של assay.
פרוטוקול זה מתאר את התהליךלהכנת 384 גם צלחות assay qRT-PCR (איור 1) עם עד שבעה עשר קבוצות שונות Pr / Pb מיקוד תת אנושי IFN (טבלת 1). Pr / Pb להגדיר עובד צלחות מקור המניה (איור 2) משמשות להכנה מרובה 384 גם צלחות assay בתהליך שיכול להיות אוטומטי באמצעות pipettor רב-ערוצי רובוטית. בעוד ההתמקדות הראשונית הייתה על יצירת פרוטוקול ללימוד חתימות ביטוי IFN אדם, שיטה זו יושמה על קופי רזוס, כמו גם. למרות צלחת הפריסות שונות במקצת וסטי Pr / Pb (טבלת 2) נבדלים, שיטת ההכנה כוללת ליצירת הצלחות האנושיות ורזוס היא זהה. עם שינויים מינימאליים של הפרוטוקול, השיטה יכולה להיות מוצאת להורג, כדי לאפשר פיתוח של מבחני ללמוד קבוצות אחרות של גנים הקשורים באופן הדוק.
דמויות ראו 1 ו -2 להלן
ראה לוחות 1 ו -2 Below
Protocol
Representative Results
Discussion
דו"ח זה מתאר עיצוב, ייצור אצווה, וגישה כלפי ניתוח של assay למדוד שעתוק של קבוצה של גנים דומים מאוד בהגדרת מעבדת מחקר. Assay qRT-PCR תפוקה הגבוהה דיווח כאן מודד את IFN- ו– תת λ עם סגוליות גבוהות. שיטה זו כרוכה שני היבטים מרכזיים, העיצוב של סטי Pr / Pb שמפלים בין בני משפחת גן הומולוגי והפיתוח של פלטפורמת הפקה ליצירת צלחות assay אמינות ועקביות 384 גם מראש עם סטי Pr / Pb. בדיקות qRT-PCR לשלב או כימי גישה מבנית (MB) (LNA) לקראת שיפור הסגוליות שלהם 29. לשתיים מקבוצות פריימר בassay רזוס (הטבלה 2), מערכת ההגברה-עקשן מוטציה (נשק) שולבה ברצפי פריימר כדי לשפר את הספציפיות 30 נוסף. בזמן שהוא בדרך כלל הטוב ביותר כדי למקד את צמתים אקסון-אקסון לenhaהספציפיות פליטות של תגובת qRT-PCR, זה לא היה אפשרי בגלל הסוג אני IFN גנים אין אינטרונים. לכן, הדנ"א הגנומי יהיה מוגבר בתגובת PCR, והוא חייב להיות מושפל על ידי טיפול DNase לאחר מיצוי RNA.
אזור היעד לסטי Pr / Pb הוגבל לאזורי הקידוד של פפטיד הבוגר לכל IFN. בגלל דמיון רצף הגבוה בקרב תת IFN-α, במיוחד באזור פפטיד הבוגר, זה היה לפעמים יש צורך להתפשר רגישות כדי להבטיח סגוליות. זה היה במיוחד המקרה עם IFN-α17, שבו יש לו את תמליל פפטיד הבוגר רק ארבעה בסיסים ייחודיים בהשוואה נגד תת IFN-α האחר. IFN-α17 מיקוד הנדרש פריימרים המחייבים את התמלילים של תת מרובים, הגבלה ספציפי לבדיקה. כתוצאה מכך, תגובת PCR תגביר סוגים אחרים מאשר IFN-α17, ובכך לצרוך אחוז ניכר של חומרים כימיים PCR וlowering את המשרעת של אות הקרינה מהבדיקה הספציפית לIFN-α17. אתגר נוסף לעיצוב סטי Pr / Pb רגישים וספציפיים לגנים דומים מאוד כגון IFN הוא האפשרות שהרצפים באתר GenBank המבואר לא יכולים להיות מלאים או מקיפים בזמן של עיצוב. שוב, זה היה אתגר עבור IFN-α17, שבו רצפים מבואר חדש לא ליישר באופן מושלם עם הגרסה של הרצף באתר בעת העיצוב. לכן, בעת תכנון Pr / Pb מציב לגנים שלא נחקרו באופן אינטנסיבי, זה חכם כדי לבדוק את הרצף המבואר האחרון של גן יעד מעת לעת. לבסוף, יש צורך להבטיח שקבוצות Pr / Pb לא להגביר פסוידו-שניתן עיבד אבל לא תורגם.
לאחר עיצוב סטי Pr / Pb, האתגר הבא הוא אופטימיזציה תנאי PCR של שבע עשרה Pr / Pb שונה קובע בצלחת אחת 384 גם. סטנדרטים תמליל הם important בבדיקת הספציפי של קבוצת Pr / Pb ולהיות חיוניים להרמונית תנאי qRT-PCR של PCR התגובות השונות ומשונות. בדיקת סט Pr / Pb נגד הסטנדרטים התמליל קובעת את היעילות והרגישות שלה; פלסמידים המבטאים פסוידו-דומה מאוד עשויים להיות נחוצים כדי להבטיח כי Pr / Pb להגדיר באופן סלקטיבי מודד שעתוק של הגן הפונקציונלי. הסטנדרטים התמליל גם לספק אמצעים כמותיים של ניתוח (מספר התמלילים), בנוסף לחצי כמותית הניתוח יחסית לגן משק (ΔCq).
pipetting רב-ערוצי רובוטית מצלחת מקור 96-היטב לתוך צלחות assay 384 גם מרובות משפר את הדיוק ועקביות של תוצאות בין-צלחת. DNA זרע סלמון (ssDNA) משמש כנשא שמייצב ומשמר את סטי Pr / Pb לאחסון ארוך טווח, כפי שעושה ייבוש ריאגנטים לוותר לתוך הצלחות. ייבוש הצלחות גם מקטין את הנפח של התגובההכרחי לתוצאות לשחזור, אשר בתורו שומרת דגימות יקרות ומפחיתה את השימוש בחומרים כימיים יקרים. באמצעות צעדים אלה, קבוצות של צלחות הם התאספו המספקות דיוק ועקביות במשך יותר משישה חודשים.
בעקבות הכנת צלחת, אמצעי בקרת איכות הוא קריטי כדי לבדוק את העקביות של קבוצה של צלחות. לצורך כך, ארבע קבוצות נוספות של סטנדרטים מנוהלות על צלחת. הצלחת "סטנדרטי 5x" עוקבת אחר ביצועים ויוצרת מערך נתונים שהסטנדרטים של צלחת פרט בהשוואה. בעוד עשרה דילולים של פי 10 של כל תקן משמשים במהלך עיצוב assay, שיקולי החלל דורשים כי ארבע נקודות משמשות לעקומה סטנדרטית על כל צלחת assay, ולצלחת סטנדרטית 5x. בנוסף, בקרה חיובית צריכה להיות כלולה בכל צלחת כדי להבטיח את תוקפו של הצלחת.
בדרך כלל, זה לוקח 3-4 שעות כדי להכין את שש צלחות assay מאחד Pr / Pb שלצלחת ource; זה אפשרי להכין שתים עשרה צלחות ביום אחד במעבדת מחקר. מאז כל צלחת assay תת אנושית IFN בוחנת שבע עשרה סטי Pr / Pb ויכולה להכיל חמישה עשר דגימות ניסוי, יום אחד של הרכבה מייצר קבוצה של צלחות עם היכולת לייצר עד 3,060 נקודות נתונים ניסיוניות. נתונים גולמיים מפלטפורמת qRT-PCR יכולים להיות מעובד ונאספו באמצעות תסריטי תכנות בתוכנת יישום גיליון אלקטרוני כדי למלא תבנית ניתוח מוגדרת מראש באופן אוטומטי. שיטה זו מקטינה את ידיים על הזנת נתונים, טעויות העתקה ובכך למנוע ומאפשרת לחוקר להתמקד בניתוח נתונים ולא הרכבה נתונים. כפי שתואר כאן, assay qRT-PCR תפוקה גבוה זה יכול להיות מיושם על מנת למדוד את הביטוי של תת אינטרפרון בדגימות מקוק רזוס אדם או ויכול להיות מותאם לשימוש עבור מינים אחרים או קבוצות גן הומולוגיות. הגמישות של פריסת הצלחת מאפשרת למשתמש לשנות את פריימר / בדיקה קובעת להתאים את הגנים שלריבית כלפי מערכת מודל סוג תא מסוים או. assay זה יכול להיות מיושם למדידת חתימות ביטוי IFN בדגמי תרבית תאים לומדים פתוגנים או בדגימות מטופל בהקשר של מודלים מחלה על מנת להבהיר את מנגנוני האיתות מעורבים בתגובה חיסונית.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency הסכם YI-AI-6153-01, קרנות ביצוע עצמיות FDA / CBER, וה- FDA הנגד רפואי היוזמה. TCT, MNB, VPM, LMS, וKDK נתמכו על-ידי מינוי לתכנית להשתתפות במחקר במרכז להערכת ביולוגיה ולמחקר מנוהל על ידי Oak Ridge המכון לחינוך מדעי באמצעות הסכם Interagency בין departmen אנרגיה של ארה"ב ובארה"ב מנהל מזון ותרופות.
Materials
| 0.2mL PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
| 12-channel Electronic Pipette, 5-250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
| 2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
| 8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
| Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
| E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
| Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
| Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
| LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
| LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
| Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
| MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
| Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
| Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
| Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
| Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
| RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
| RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
| Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
| SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
| ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
| Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
| Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
| Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
| Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |
Referencias
- Yan, N., Chen, Z. J. Intrinsic antiviral immunity. Nature. 13, 214-222 (2012).
- Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).
- Baum, A., Garcia-Sastre, A. Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates. Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).
- Kotenko, S. V., et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nature. 4, 69-77 (2003).
- Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics. 84, 331-345 (2004).
- Cheon, H., et al. IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage. The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).
- Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).
- Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses. Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).
- Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).
- Huang, J., et al. Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).
- Bidwell, B. N., et al. Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape. Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).
- Di Domizio, J., Cao, W. Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases. Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).
- Crow, Y. J., Casanova, J. L. STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy – A New Interferonopathy. The New England journal of medicine. , (2014).
- Bermel, R. A., Rudick, R. A. Interferon-beta treatment for multiple sclerosis. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).
- Kingham, J. G., et al. Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon. Gut. 19, 91-94 (1978).
- Heathcote, J., Main, J. Treatment of hepatitis C. Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).
- Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O’Brien, T. R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection. Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).
- Castaigne, S., et al. Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia. Cancer. 57, 1681-1684 (1986).
- Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia. The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).
- Dai, C., et al. Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure. Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).
- Maeda, S., et al. Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line. The Journal of biological chemistry. , (2014).
- Xia, C. Q., et al. Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production. Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).
- Hervas-Stubbs, S., et al. Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming. Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).
- Manry, J., et al. Evolutionary genetic dissection of human interferons. The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).
- Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. Diversity and relatedness among the type I interferons. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).
- Fox, B. A., Sheppard, P. O., O’Hara, P. J. The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family. PloS one. 4, e4933 (2009).
- Hillyer, P., et al. Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent. Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).
- Schramm, L. M., et al. High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).
- Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid. Theranostics. 3, 395-408 (2013).
- Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines … [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).
