Высокая пропускная способность Количественный реальном времени RT-PCR анализа для определения профилей экспрессии типов I и III интерферона подтипов
Summary
This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.
Abstract
Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.
Introduction
Типы I и III интерфероны (IFN) имеют решающее значение в иммунной реакции на наличие вирусов и других патогенных раздражителей и присутствует во всех позвоночных 1. Иммунные и не иммунные клетки экспрессируют и секретируют, а также реагировать на, IFN 2. Врожденная иммунная датчики, такие как Toll-подобные рецепторы (TLR), Стинг, и RIG-I, вызывают Тип I и выражение III IFN при обнаружении патогенных связанные молекулярные модели (PAMP) 3,4. У человека, тип I IFN включают интерферон-β, -ω, -κ и 12 подтипов IFN-α, и связываются с рецептором IFNAR1 / IFNAR2 комплекса 2,5. Тип III IFN включают интерферон-λ1, -λ2 и -λ3 и связываются с рецептором комплекса IL10RB / IL28RA 2. Классически, типы I и III IFN связываются с соответствующими рецепторных комплексов, которые затем нанимают stat1 / stat2 гетеродимеры и инициировать транскрипцию интерферона стимулируется генов (ISG) 6. ISG участвуют в разнообразных функций, от противовирусной и антипролиферативная активность к активации адаптивного иммунного ответа 7.
Многочисленные механизмы патогены эволюционировали, чтобы избежать, подорвать и захватить элементы пути IFN сигнализации продемонстрировать важность IFN в врожденного иммунного ответа 8. Например, вирус коровьей оспы выражает приманка рецептор с IFNAR1 гомологии, что секвестров IFN типа I 9, а вирус Yaba, как болезнь выделяет гликопротеин, который ингибирует введите белки I и III ИФН 10. В дополнение к их роли в защите хозяина, IFN также участвуют в наблюдении рака и ряда авто-воспалительных заболеваний: молчание IFN экспрессии в клетках рака молочной железы ограничивает иммунного 11, перепроизводство IFN-α является механизм в развитии системного красная волчанка 12, и странствующий активации Стинга приводит к системной воспалительной реакции, вызванной чрезмерным количеством IFN в STING-ассоциированной васкулопатии13. Терапевтически, ИФН используются для лечения рассеянного склероза 14, хронические вирусные инфекции, такие как HBV 15 и HCV 16,17 и раковых заболеваний, таких как волосистой клеточной лейкемии 18 и хронический миелолейкоз 19. Вопросы о значимости ИФН в конкретном физиологическом процессе постоянно показывают универсальную природу этого семейства цитокинов.
IFN типа I, особенно ИФН-α подтипов, которые часто рассматриваются как единое целое 20-23, а не в качестве группы тесно связаны, но различны, белков. Существование и сохранение нескольких видов, включая IFN IFN-α подтипов, в ходе эволюции позвоночных 24 предполагает, что, по меньшей мере подмножество этих подтипов имеют специфические или уникальные функции. Вполне возможно, что, определяющие паттерны экспрессии IFN будет расшифровывать и помочь характеризуют специфические функции одного или нескольких подтипов 17. Задача изучения тон типа подтипа I и III ИФН на основе их идентичности общей последовательности: двенадцать IFN-α подтипы поделиться> 50% 25 и IFN-λ подтипы поделиться 81-96% 26 аминокислотных последовательностей. В описываемом Qrt-ПЦР, молекулярно-маяка (МБ) и закрывается нуклеиновой кислоты (LNA) флуоресцентные зонды различить одиночные различия пар оснований между высокой подобных последовательностей подтипа ИФН и позволяют для характеристики экспрессии IFN подписи. Формат пластина 384-а для анализа включает в себя как количественные (стандарты стенограмма) и полу-количественные (гены хозяйствования (HKG)) меры, позволяющие для анализа числа стенограмма копирования и ΔCq соответственно. Пакетная сборка, способствует автоматизированной многоканальной пипетки и длительного хранения, возможной в результате сушки грунтовки / зонд (Pr / Pb) устанавливает на пластинах, повысить воспроизводимость, полезность и практичность анализа.
Этот протокол описывает процессдля подготовки 384-а Qrt-ПЦР пластины (рис 1) с до семнадцати различных наборов Pr / Pb, направленных на подтипы человека ИФН (таблица 1). Pr / Pb установлено источником рабочего акции пластины (рис 2) используются для приготовления кратное 384-а Планшеты в процессе, который может быть автоматизирован с помощью роботизированной многоканальной пипетки. Хотя первоначальный акцент был на создании протокол для изучения подписей экспрессии IFN человека, этот метод был применен к резус-макак, а также. Хотя пластины макеты немного отличаются и множества Pr / Pb (таблица 2) различны, в целом способ получения для создания человека и резус пластины идентично. С минимальными изменениями протокола, метод может быть выполнен для обеспечения развития анализах для изучения других групп, тесно связанных генов.
Смотрите рисунки 1 и 2 ниже
См таблицах 1 и 2 Белой
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот отчет описывает дизайн, серийное производство, и подход к анализу анализе для измерения транскрипцию набора четко подобных генов в условиях научно-исследовательской лаборатории. Высокой пропускной Qrt-ПЦР-анализ сообщили здесь измеряет ИФН и – λ подтипы с высокой специфичностью. Этот метод включает в себя два ключевых аспекта, дизайн Pr / Pb наборов, которые являются дискриминационными между членами гомологического семейства генов и развитие производственной платформы для создания надежных и последовательных аналитических планшетов 384-а с предустановленной множеств Pr / Pb. Зонды Qrt-ПЦР включить структурную (МБ) или химических (LNA) подход к повышению их специфику 29. Для двух наборов праймеров в резус-анализа (таблица 2), усиление огнеупорный система мутация (ARMS) была включена в праймера для дальнейшего повышения специфичности 30. Хотя в целом все возможное, чтобы предназначаться экзон-экзон переходов на enhaсть, специфичность реакции Qrt-PCR, это было невозможно, потому что тип I IFN гены не хватает интронов. Таким образом, геномной ДНК будет усилен в ПЦР-реакции, а должен быть снижено путем обработки ДНКазой после экстракции РНК.
Область-мишень для множеств Pr / Pb был ограничен кодирующих областей зрелого пептида для каждой IFN. Из-за сходства высокой последовательности между IFN-α подтипов, в частности зрелого пептида области, иногда было необходимо поставить под угрозу чувствительность, чтобы обеспечить специфичность. Это было особенно в случае с IFN-α17, где зрелый пептид стенограмму имеет только четыре уникальные баз по сравнению с другими IFN-α подтипов. Ориентация IFN-α17 требуется праймеров, которые связывают расшифровку нескольких подтипов, ограничивая специфичность зонда. Как следствие, реакцию ПЦР будет усиливать другие подтипы, чем IFN-α17, тем самым потребляя значительный процент реагентов ПЦР и loweriнг амплитуду сигнала флуоресценции от специфического зонда для IFN-α17. Дополнительной проблемой в отношении разработки чувствительных и конкретные наборы Pr / Pb для очень подобных генов, таких как IFN возможность того, что аннотированные последовательности в базе данных GenBank, не может быть полным или комплексное в момент конструкции. Опять же, это был вызов для IFN-α17, в котором вновь аннотированный последовательности не точно соответствующую версии последовательности в базе данных на момент проектирования. Поэтому при проектировании Pr / Pb наборы для генов, которые не были интенсивно изучал, имеет смысл периодически проверять последнюю аннотированный последовательность гена-мишени. И, наконец, необходимо обеспечить, чтобы множества Pr / Pb не усиливает псевдогенов, которые могут транскрипции, но не переведены.
После разработки множества Pr / Pb, следующей задачей является оптимизация условий ПЦР из семнадцати различных Pr / Pb устанавливает на одном 384-луночного планшета. Стандарты транскрипта важTant в тестировании специфику набора Pr / Pb и стать важным для согласования условий Qrt-ПЦР из множества различных реакций ПЦР. Тестирование набор Pr / Pb по стандартам транскриптов устанавливает свою эффективность и чувствительность; плазмиды, которые выражают очень похожи псевдогенов могут быть необходимы для того, чтобы Pr / Pb установлено выборочно измеряет транскрипцию функционального гена. Стандарты транскриптов также дать количественную средства анализа (количество транскриптов), в дополнение к полуколичественного анализа по отношению к гену домашнего хозяйства (ΔCq).
Роботизированная многоканального пипетирования из исходного 96-луночного планшета в нескольких аналитических планшетов 384-луночных улучшает точность и согласованность результатов между пластин. ДНК спермы лосося (оцДНК) используется в качестве носителя, который стабилизирует и сохраняет наборы Pr / Pb для длительного хранения, так же как и сушки реагенты разливают в пластинах. Сушка пластин также снижает объем реакциинеобходимо для воспроизводимости результатов, которые, в свою очередь, сохраняющий драгоценные образцы и уменьшает применения дорогостоящих реагентов. С помощью этих шагов, партии пластин собраны, которые обеспечивают точность и согласованность в течение более шести месяцев.
После получения пластины, показатели качества управления имеют решающее значение для проверки согласованности партии пластин. С этой целью еще четыре набора стандартов выполняются на тарелке. "5x стандарт" пластина отслеживает производительность и создает набор данных, к которому стандарты отдельная плита сравниваются. В то время как десять 10-кратные разведения каждого стандарта используются при проектировании анализа, космические соображения требуют, чтобы четыре точки используются для стандартной кривой в каждом анализе пластины, и для стандартной пластины 5x. Кроме того, положительный контроль должен быть включен в каждую тарелку, чтобы обеспечить достоверность пластины.
Как правило, это занимает 3-4 ч, чтобы подготовить шесть Планшеты от одного Pr / Pb ст о ч н пластина; это возможно, чтобы подготовить двенадцать плит в один день в научно-исследовательской лаборатории. Поскольку каждый человек IFN подтипа планшету рассматривает семнадцать наборы Pr / Pb и может вместить пятнадцать опытных образцов, в один прекрасный день сборки производит партию пластин с возможностью генерировать до 3060 экспериментальных точек. Исходные данные с платформы Qrt-ПЦР могут быть обработаны и собраны с использованием сценариев программирования в редакторе электронных таблиц приложений для автоматического заполнения шаблона предварительно разработанную анализа. Этот метод минимизирует руки-на ввод данных, тем самым предотвращая ошибки копирования и позволяет исследователю сосредоточиться на анализе данных, а не сборки данных. Как описано здесь, это высокой пропускной QRT-ПЦР-анализ может быть применен для измерения экспрессии интерферона подтипов в образцах человека или макаки-резус и могут быть адаптированы для использования в других видов или гомологичных наборов генов. Гибкость планировки пластины позволяет пользователю изменять грунтовки / зонд наборы адаптировать геныИнтерес к клеткам конкретного типа или модели системы. Этот анализ может быть применен для измерения IFN подписи выражение в модели культуры клеток, изучающих патогенные или в образцах пациента в контексте моделей заболеваний для выяснения сигнальных механизмов, участвующих в иммунной реакции.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана CBER / FDA-NIAID / NIH межведомственное соглашение Yi-AI-6153-01, FDA / СБЕР очной средств, и FDA медицинских контрмер против инициативы. TCT, МНБ, VPM, LMS, и КДК были поддержаны назначения на исследовательскую программу участия в Центре биопрепаратов по оценке и исследованиям в ведении Ок-Ридж Института научного образования на основе соглашения Межведомственной между США зав.отделением энергетики и США пищевых продуктов и медикаментов.
Materials
| 0.2mL PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
| 12-channel Electronic Pipette, 5-250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
| 2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
| 8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
| Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
| E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
| Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
| Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
| LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
| LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
| Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
| MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
| Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
| Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
| Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
| Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
| RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
| RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
| Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
| SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
| ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
| Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
| Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
| Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
| Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |
Referencias
- Yan, N., Chen, Z. J. Intrinsic antiviral immunity. Nature. 13, 214-222 (2012).
- Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).
- Baum, A., Garcia-Sastre, A. Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates. Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).
- Kotenko, S. V., et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nature. 4, 69-77 (2003).
- Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics. 84, 331-345 (2004).
- Cheon, H., et al. IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage. The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).
- Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).
- Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses. Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).
- Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).
- Huang, J., et al. Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).
- Bidwell, B. N., et al. Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape. Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).
- Di Domizio, J., Cao, W. Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases. Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).
- Crow, Y. J., Casanova, J. L. STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy – A New Interferonopathy. The New England journal of medicine. , (2014).
- Bermel, R. A., Rudick, R. A. Interferon-beta treatment for multiple sclerosis. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).
- Kingham, J. G., et al. Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon. Gut. 19, 91-94 (1978).
- Heathcote, J., Main, J. Treatment of hepatitis C. Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).
- Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O’Brien, T. R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection. Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).
- Castaigne, S., et al. Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia. Cancer. 57, 1681-1684 (1986).
- Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia. The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).
- Dai, C., et al. Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure. Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).
- Maeda, S., et al. Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line. The Journal of biological chemistry. , (2014).
- Xia, C. Q., et al. Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production. Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).
- Hervas-Stubbs, S., et al. Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming. Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).
- Manry, J., et al. Evolutionary genetic dissection of human interferons. The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).
- Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. Diversity and relatedness among the type I interferons. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).
- Fox, B. A., Sheppard, P. O., O’Hara, P. J. The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family. PloS one. 4, e4933 (2009).
- Hillyer, P., et al. Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent. Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).
- Schramm, L. M., et al. High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).
- Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid. Theranostics. 3, 395-408 (2013).
- Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines … [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).
