Manchas de sangre seca - preparación y procesamiento para su uso en inmunoensayos y en técnicas moleculares

DBS se han utilizado durante 100 años² pero, sorprendentemente, todavía hay no hay un consenso general sobre su preparación y procesamiento. Hasta la fecha, una suficiente estandarización de esta importante fase pre-analítica sólo se ha logrado en el campo de la evaluación del recién nacido¹⁴, considerando que existe una variedad de diferentes protocolos para todas las demás aplicaciones de DBS de prueba^{5, 16, 23}. Para superar esta heterogeneidad notable, una completa instrucciones paso a paso para la preparación y procesamiento de DBS a utilizarse a inmunoensayos y por técnicas moleculares se presenta en esta comunicación y evaluados en cuanto a su eficacia para la detección de marcadores de VHB, VHC y VIH infecciones. El foco de la discusión siguiente se coloca principalmente en los distintos pasos del protocolo sugerido.

En la historia de DBS prueba muchos papel de filtro diferentes tarjetas han sido utilizadas² pero hoy solamente dos fuentes comerciales son aprobadas por la FDA como dispositivos médicos de clase II para colección de sangre^{5, 16}. Estos sistemas de filtro de la tarjeta son muy uniformes y tienen características muy similares de absorción para que los resultados analíticos obtenidos de sangre capilar, preparado en cualquiera de ellos no difieren en más de 4% – 5%²⁸. No en vano, Masciotra y colaboradores²⁹ por lo tanto detecta VIH-1 ARN igualmente bien con un análisis cualitativo después de elución de las tarjetas de colección de sangre de diferentes fuentes. Teniendo en cuenta estos datos, que puede ser prácticamente excluido que cualquiera de las discrepancias observadas cuando juntado parejas suero/DBS por marcadores de VHB, VHC y VIH infecciones¹⁷ fue causado por la elección de la tarjeta de filtro solo. Sin embargo, cuando precisa cuantificación de un analito es indispensable, a la fuente variación ya no puede ser insignificante y técnicas más sofisticadas, por ejemplo, perforada DBS (PDBS) como un método para microsampling³⁰ o la preparación de manchas de suero seco (DSS)³¹ deba aplicarse en lugar de DBS convencional prueba¹⁰.

Puesto que sólo pequeñas cantidades de sangre se utilizan para pruebas de DBS (una gota de sangre capilar consiste en aproximadamente 50 μL)^{5, 16}, las variaciones en el volumen de la muestra son cruciales y, ciertamente, al menos algunas de las discrepancias entre resultados serológicos y de los participantes informaron estado VHB y VHC en el pilotaje del “Estudio de DRUCK” son atribuibles a esta variable. El factor más importante para reducir al mínimo las “fluctuaciones” del volumen de muestra es sin duda una técnica correcta de recolección de sangre capilar, que sólo puede lograrse mediante la cuidadosa y constante capacitación del personal técnico²². Además, como medida de control de calidad, todos los laboratorios trabajando con DBS deben haber ya iniciado procedimientos para identificar y posteriormente excepto a muestras DBS que tienen que ser considerados como insatisfactoria o nula¹⁶.

Estudios realizados principalmente en el contexto del VIH³² y evaluación del recién nacido³³ han demostrado que la alta humedad puede conducir a una degradación de analitos, pero hasta ahora no se ha alcanzado ningún consenso con respecto a la pregunta de cuánto tiempo DBS debe ser secado al aire . Un intervalo de al menos 4 horas o de preferencia O/N se propone en esta comunicación, que por lo tanto, las condiciones que se utilizaron en la gran mayoría de todas las publicaciones relevantes^{32, 34} datos en almacenamiento de información de DBS para ser utilizado posteriormente para VHB y VHC prueba son contradictorios. En 1981, Villa y compañeros de trabajo³⁵, que aplica técnicas de análisis contemporáneas, informó de que almacenamiento a temperatura ambiente no afectó los resultados de análisis de VHB durante el período de observación completa de 180 días si fueron los títulos de anticuerpos > 1/1.000, sino que la DBS se convirtió en frontera-positivos o incluso negativos después de 15 días cuando los títulos en suero eran sólo 1/100. Almacenamiento a-20 ° C o 4 ° C no se tradujo en una mejora sustancial. En contraste, un estudio llevado a cabo treinta años más tarde³⁶ probado réplicas de una muestra de VHB positivo, y los autores encontraron anti-HBc, así como los anticuerpos anti-HBs fueron estables hasta por 183 días a temperatura ambiente, considerando que el HBsAg en las mismas condiciones se convirtió en falsos negativos ya después de 63 días. Con respecto a la detección de ADN de VHB de eluatos DBS, la concentración del ácido nucleico viral era estable durante al menos siete días a 37 ° C³⁷ o demostró para ser “resistente” a almacenamiento a temperatura ambiente hasta por tres semanas³⁸. Pruebas para anticuerpos anti-VHC usando dos tercera generación disponible comercialmente inmunoensayos³⁹ proporciona resultados precisos para un período de 117 días usando DBS muestras almacenadas a-20 ° C, 2 – 8 ° C y 20 – 25 ° C, respectivamente. Almacenamiento a-20 ° C, sin embargo, dio lugar a la menor variación de densidades ópticas. Aplicación de una cuarta generación anti-HCV ELISA, es decir, Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, en el contexto de la DBS pruebas, Larrat et al. ⁴⁰ se observó un descenso agudo en especificidad analítica después de guardar a las muestras DBS durante más de tres días a TA. Por otro lado, se obtuvieron resultados precisos de pruebas con el mismo equipo utilizando muestras depositadas durante 60 días en diversas condiciones (-20 ° C, 2 – 8 ° C y 22-26 ° C) por Brandao y colaboradores⁴¹. Observaciones sobre la disminución de las concentraciones de ARN del VHC en DBS bajo diferentes condiciones de almacenamiento van desde ninguna alteración significativa a temperatura ambiente por hasta un año⁴² un cambio diez veces después de cuatro semanas a temperatura ambiente de⁴³. Tomando estos datos algo contradictorios en la estabilidad de HBV y HCV antígenos, ácidos nucleicos y anticuerpos en cuenta, parecía razonable retraer en el protocolo propuesto a un consenso, que fue definido anteriormente para el almacenamiento de las muestras DBS para VIH prueba^{15, 30}: de depósito a corto plazo (hasta dos semanas) anticuerpos, antígenos y ácido nucleico viral se consideran estable a temperatura ambiente, considerando que es óptima de almacenamiento por períodos más largos en condiciones heladas.

Como regla general, tres parámetros deben ser considerados al diseñar un protocolo de elución: (1) el tampón de elución; (2) la duración y temperatura de elución; y (3) el volumen de elución²³. En la mayoría de las publicaciones pertinentes con tampón fosfato salino (PBS) fue utilizado para liberador de DBS, y mayoría de los autores ha añadido una proteína, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) o Tween 20, un surfactante, para mejorar la señal de ensayo con la estabilización de proteínas, como entran en solución y al mismo tiempo bloqueo sitios de fijación no específica²³. Solamente algunos informes, que comparan directamente tampones de elución diferentes en el contexto de la prueba de DBS, están disponibles. Villar et al. ³⁶, por ejemplo, registró capacidad de elución prácticamente equivalente para todos los búferes usados, pero PBS/BSA 0.5% resultó en el nivel más bajo de la reactividad inespecífica. Una observación muy similar fue hecha por Croom y compañeros de trabajo⁴⁴ al aplicar el diluyente de muestra de la genética sistemas rLAV EIA para la elución de los anticuerpos anti-VHC de DBS. Puesto que el riesgo de degradación de la muestra es excesivamente bajo en las primeras horas después de la preparación de DBS (véase arriba), se decidió a incubar las manchas O/N en la temperatura ambiente y para apoyar el proceso de elución mezclando suave sobre un extremo. Este enfoque tiene la ventaja de que ejemplares perforados fuera el anterior día puede ser transferido directamente al diagnóstico rutinario temprano la siguiente mañana²³. El volumen del buffer de elución debe adaptarse a los requisitos mínimos respectivos de los análisis utilizados para los análisis posteriores para mantener el factor de dilución tan bajo como sea posible. Sin embargo, una cuidadosa optimización de las condiciones de elución para cada analito individual no era posible en la evaluación anterior debido a un rendimiento alto tenía que garantizarse en un comparativamente a corto plazo en el “Estudio de DRUCK”¹⁷. En consecuencia, el volumen más bien desfavorable de 1000 μl de tampón de PBS-basado fue utilizado para completar el proceso de elución todo para todos los parámetros en dos operaciones separadas.

Este enfoque una parte falla “completamente en el sistema de anti-HBc/anti-HBs para las personas infectadas con el VIH debido a las concentraciones bajas de anticuerpos; … y requiere procedimientos biológicos moleculares con óptima sensibilidad analítica con respecto a la DNA de HBV y HCV RNA pruebas. ” ¹⁷ por otra parte, el volumen de elución alta resultó para ser de ninguna manera para la determinación de HBsAg, anti-HCV y anti-VIH por los kits utilizados en la evaluación. “La detección de HBsAg positivos materiales de eluatos de sangre tuvo éxito con una sensibilidad de 98,6% a un igualmente alto grado como en estudios anteriores, que en parte había utilizado un menor volumen de elución de 100 μl, 250 μl, 600 μl o 500 μl”^{17 ,36, 45, 46}. La sensibilidad de 97,8% determinado en la investigación de 179 parejas suero/DBS para anticuerpos anti-HCV correspondieron a los resultados de la ya existente informa^{24, 44, 47, 48, 49}, que había trabajado con un volumen de elución que fue menor en un factor de 5 a 10. “Además, los protocolos para la detección de anticuerpos anti-VHC habían sido adecuadamente optimizados… por estipulando sus propios puntos de corte”^{17, 24, 48, 49} “, o mediante el aumento de los volúmenes de muestra de 20 μl a 100 μl. ^{17, 49} finalmente, la especificidad analítica y la sensibilidad (100%) establecido para la detección de anti-VIH fueron iguales o superiores a las características de rendimiento de otros inmunoensayos adaptadas específicamente a DBS^{50, 51} de prueba “o un paso a paso procedimiento con el uso combinado de varias pruebas anti-VIH”^17,52. “Ellos, en efecto, también superaron el récord de rendimiento de un ensayo que había sido especialmente desarrollado y optimizado para la detección de anticuerpos anti-VIH en eluídos DBS (Q prevenir HIV 1 + 2 kit de DBS).” ^{17, 53}  

Tomados en conjunto, el protocolo paso a paso integral presentado en esta comunicación demostró para ser una herramienta factible y fácil de usar para la preparación y procesamiento de DBS y por lo tanto, puede, ser utilizado confiablemente en virología diagnóstica. Permite enfoques utilizando automatización ⁵⁴ y debido a sus características de funcionamiento excelentes tiene el potencial de servir como una especie de cimiento para un protocolo futuro consenso generalmente aceptado en el campo global de DBS pruebas en laboratorio medicina.