Gedroogde bloed vlekken - voorbereiden en verwerken voor gebruik in immunoassay en moleculaire technieken

DBS voor 100 jaar² zijn gebruikt, maar verrassend, is er nog geen algemene consensus over de voorbereiding en de verwerking. Tot op heden, een voldoende standaardisatie van deze belangrijke pre analytische fase alleen geboekt op het gebied van pasgeboren screening¹⁴, overwegende dat een verscheidenheid van verschillende protocollen bestaat voor alle andere toepassingen voor DBS testen^{5, 16, 23}. Om te overwinnen deze opmerkelijke heterogeniteit, een uitgebreide stapsgewijze instructie voor de voorbereiding en verwerking van DBS te worden gebruikt in immunoassay en door moleculaire technieken gepresenteerd in deze mededeling en geëvalueerd met betrekking tot de doeltreffendheid ervan voor het detecteren van merkers van HBV, HCV en HIV-infecties. De focus van de volgende discussie wordt voornamelijk gelegd op de verschillende stappen van het voorgestelde protocol.

In de geschiedenis van DBS testen van vele verschillende filtreerpapier kaarten geweest gebruikte² maar vandaag slechts twee commerciële bronnen zijn goedgekeurd door de FDA als klasse II medische hulpmiddelen voor bloed collectie^{5, 16}. Deze filter kaartsystemen zijn zeer uniform en hebben zeer vergelijkbaar absorptie-eigenschappen zodat de analytische resultaten van capillaire bloed bereid op een van hen niet van elkaar verschillen door meer dan 4%-5%²⁸. Niet verrassend, Masciotra en collega’s²⁹ daarom gedetecteerd HIV-1 RNA evengoed met een kwalitatieve test na de elutie van bloed collectie kaarten van verschillende bronnen. Gelet op deze gegevens, kan het worden vrijwel uitgesloten dat een van de verschillen waargenomen bij het testen van combinatie serum/DBS paren voor markeringen van HBV, HCV en HIV infecties¹⁷ werd veroorzaakt door de keuze van de filterkaart alleen. Echter wanneer nauwkeurige kwantificering van een analyt onmisbaar is, bron-naar-bronvariatie kan niet langer te verwaarlozen en meer geavanceerde technieken, bijvoorbeeld, geperforeerd DBS (PDBS) als een methode voor microsampling³⁰ of de voorbereiding van gedroogde serum vlekken wellicht (DSS)³¹ moeten worden toegepast in plaats van conventionele DBS¹⁰testen.

Aangezien alleen kleine hoeveelheden bloed worden gebruikt voor DBS testen (een druppel van capillaire bloed bestaat uit ongeveer 50 µl)^{5, 16}, variaties in het monstervolume zijn van cruciaal belang en, toegegeven, althans een aantal van de verschillen tussen de resultaten van de serologische en de deelnemer zelf-gerapporteerde status van het HBV en HCV opgenomen tijdens de loodsen van de “DRUCK studie” te wijten zijn aan deze variabele. De belangrijkste factor voor het minimaliseren van “schommelingen” van het monstervolume is ongetwijfeld een juiste techniek van capillaire bloed collectie, die alleen kan worden bereikt door zorgvuldige en voortdurende opleiding van het technisch personeel-²². Bovendien, als een maatregel van kwaliteitscontrole, moeten alle laboratoria die werken met DBS reeds ingeleid procedures voor het identificeren en vervolgens met uitzondering van DBS specimens die moeten worden beschouwd als onbevredigend of ongeldige¹⁶.

Studies uitgevoerd voornamelijk in het kader van HIV³² en pasgeboren screening³³ hebben aangetoond dat hoge luchtvochtigheid kan leiden tot een aantasting van de analyten, maar tot nu toe heeft geen consensus is bereikt wat betreft de vraag hoe lang de DBS moet aan . Een interval van ten minste 4 uur of bij voorkeur O/N wordt voorgesteld in deze mededeling, die derhalve aangenomen voorwaarden die werden gebruikt in de overgrote meerderheid van alle relevante publicaties^{32, 34} gegevens over opslag van DBS worden vervolgens gebruikt voor HBV en HCV testen zijn tegenstrijdig. In 1981, Villa en collega’s³⁵, die hedendaagse analytische technieken toegepast, gemeld dat opslag bij RT niet de resultaten van analyses van de HBV tijdens de volledige observatieperiode van 180 dagen beïnvloedde als antilichamen titers > 1/1.000, maar dat DBS borderline-positieve of zelfs negatief werd na 15 dagen wanneer de titers in het serum slechts 1/100 werden. Opslag bij-20 ° C of 4 ° C niet leiden tot een aanzienlijke verbetering. In tegenstelling, een studie uitgevoerd dertig jaar later³⁶ getest worden gerepliceerd van een HBV-positief monster, en de auteurs gevonden die anti-HBc net zo goed als anti-HBs antilichamen waren stabiel voor maximaal 183 dagen op RT, terwijl HBsAg onder dezelfde voorwaarden werd vals-negatieve al na 63 dagen. Ten aanzien van HBV DNA detectie van DBS eluaten, de concentratie van de virale nucleïnezuur was stabiel gedurende ten minste zeven dagen bij 37 ° C³⁷ of bleek te zijn “resistente” naar opslag op RT voor maximaal drie weken³⁸. Testen voor anti-HCV antilichamen met behulp van twee verkrijgbare derde generatie immunoassay³⁹ nauwkeurige resultaten opgeleverd voor een periode van 117 dagen met behulp van DBS monsters opgeslagen bij-20 ° C, 2-8 ° C en 20-25 ° C, respectievelijk. Opslag bij-20 ° C, echter, resulteerde in de laagste variatie van optische dichtheden. Toepassing van een vierde generatie anti-HCV ELISA, dat wil zeggen, Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, in het kader van de DBS testen, Larrat et al. ⁴⁰ waargenomen een scherpe afname van de analytische specificiteit na het opslaan van de DBS-exemplaren voor meer dan drie dagen op RT. Aan de andere kant, werden precieze testende resultaten bekomen met dezelfde kit met gebruikmaking van monsters afgezet gedurende 60 dagen onder verschillende omstandigheden (-20 ° C, 2-8 ° C en 22-26 ° C) door Brandao en medewerkers⁴¹. Opmerkingen over de daling van de concentraties van de HCV-RNA in DBS onder verschillende opslagcondities variëren van geen aanzienlijke wijziging op RT voor maximaal één jaar⁴² tot een tienvoudige verandering na vier weken bij omgevingstemperatuur⁴³. Deze nogal tegenstrijdige gegevens op de stabiliteit van HBV en HCV-antigenen, nucleïnezuren en antilichamen in aanmerking nemen, leek het redelijk te trekken in het voorgestelde protocol tot een consensus, die eerder was gedefinieerd voor de opslag van DBS specimens worden gebruikt voor HIV-tests^{15, 30}: voor korte termijn afzetting (maximaal twee weken) antigenen, virale nucleic zuur, en antilichamen worden beschouwd als stabiel op RT, overwegende dat optimale opslag voor langere perioden bevroren voorwaarden.

Als een regel, drie parameters moeten worden overwogen bij het ontwerpen van een elutie protocol: (1) de elutie buffer; (2) de duur en de temperatuur van de elutie; en (3) het elution volume²³. In de overgrote meerderheid van alle relevante publicaties-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) werd gebruikt voor eluerende DBS, en de meeste auteurs toegevoegd een eiwit, bijvoorbeeld, bovien serumalbumine (BSA) of tween-20, een oppervlakteactieve stof, teneinde het assay-signaal door te stabiliseren eiwitten, zoals ze gaan in de oplossing, en tegelijkertijd blokkeren aspecifieke bindende sites²³. Alleen een paar verslagen, die direct verschillende elutie buffers in het kader van de DBS testen vergelijken, zijn beschikbaar. Villar et al. ³⁶, bijvoorbeeldopgenomen bijna gelijkwaardig elutie capaciteiten voor alle buffers gebruikt, maar PBS/BSA 0,5% resulteerde in het laagste niveau van aspecifieke reactiviteit. Een zeer soortgelijke constatering werd gemaakt door Croom en collega’s⁴⁴ bij de toepassing van het specimen verdunningsmiddel van de genetica systemen rLAV Mer voor de elutie van anti-HCV-antistoffen van DBS. Aangezien het risico van aantasting van het monster is buitengewoon laag in de eerste uren na voorbereiding van DBS (zie hierboven), was het besloten om de vlekken O/N bij kamertemperatuur incuberen en de elutie om proces te ondersteunen door het zacht mengen van eind over. Deze aanpak heeft het voordeel dat de specimens de vorige uitgestanst dag kan worden rechtstreeks overgedragen aan routine diagnostiek vroeg de volgende ochtend²³. Het volume van de elutie buffer moet worden aangepast aan de respectievelijke minimale eisen van de tests gebruikt voor latere analyses om de verdunningsfactor zo laag mogelijk te houden. Een zorgvuldige optimalisatie van de elution voorwaarden voor elke één analyt was echter niet mogelijk bij de voorafgaande evaluatie omdat veel monsters worden verwerkt moest worden gegarandeerd in een relatief korte tijd tijdens de “DRUCK Study”¹⁷. Bijgevolg werd het nogal ongunstige volume van 1.000 µl van PBS gebaseerde buffer gebruikt om de hele elutie proces voor alle parameters in twee aparte verrichtingen te voltooien.

Deze aanpak een enerzijds mislukt “volledig in het systeem van de anti-HBc/anti-HBs voor die individuen die besmet zijn met HIV als gevolg van de lage antilichaam concentraties; … en het moleculaire biologische procedures vereist met optimale analytische gevoeligheid ten aanzien van HBV-DNA en HCV-RNA tests. ” ¹⁷ aan de andere kant, het hoge elutievolume bleek te zijn op geen enkele wijze nadelig zijn voor de bepaling van HBsAg, anti-HCV en anti-HIV door de kits gebruikt tijdens de evaluatie. “De detectie van HBsAg positieve materialen van volbloed eluaten opgevolgd met een gevoeligheid van 98,6% tot een zo hoge mate zoals in eerdere studies, die had een veel kleinere elutievolume van 100 µL, 250 µl, 600 µl of 500 µl gedeeltelijk gebruikt”^{17 ,36, 45, 46}. De gevoeligheid van 97.8% bepaald in het onderzoek van 179 serum/DBS paren voor anti-HCV-antistoffen overeenkwam met de resultaten van het reeds bestaande rapporten^{24, 44, 47, 48, 49}, die had gewerkt met een elutievolume die lager met een factor 5 tot en met 10 was. “Bovendien, de protocollen voor anti-HCV detectie had op de juiste wijze geoptimaliseerd… door hun eigen licht-donkerscheiding punten”^{17, 24, 48, 49} “of door het verhogen van de volumes van de steekproef van 20 µl tot 100 µl.” ^{17, 49} tot slot de analytische specificiteit en de gevoeligheid (100% elk) vastgesteld voor de detectie van de anti-HIV waren superieur aan de prestatiekenmerken van andere immunoassay specifiek aangepast aan DBS testen van^{50, 51} of gelijk “of van een stapsgewijze procedure met het gecombineerd gebruik van verschillende anti-HIV-tests”^17,52. “Zij, inderdaad, ook overschreden de record van de prestaties van een bepaling die had speciaal ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de detectie van de anti-HIV antilichamen in DBS eluaten (Q-voorkomen van HIV-1 + 2 DBS kit).” ^{17, 53}  

Tezamen, het uitgebreide stapsgewijze protocol gepresenteerd in deze mededeling een haalbaar en gebruiksvriendelijk instrument voor de voorbereiding en verwerking van DBS gebleken en kan dus, op een betrouwbare manier gebruikt worden in Diagnostische Virologie. Het staat met behulp van automatisering ⁵⁴ benaderingen en vanwege haar uitstekende prestatiekenmerken heeft het potentieel om te dienen als een soort van fundament voor een toekomstige algemeen aanvaarde consensus-protocol op het algemene gebied van DBS testen in het laboratorium geneeskunde.