بقع الدم المجفف-إعداد وتجهيز لاستخدامها في تحديدكم والتقنيات الجزيئية

DBS قد استخدمت لسنوات 100² ، لكن المثير للدهشة، لا يزال هناك لا توافق عام في الآراء حول إعداد وتجهيز. وحتى الآن، توحيد كافية في هذه المرحلة التحليلية السابقة الهامة فقط قد أحرز في مجال فحص حديثي الولادة¹⁴، بينما توجد مجموعة متنوعة من البروتوكولات المختلفة لكافة التطبيقات الأخرى من DBS الاختبار^{5، 16، 23}. للتغلب على هذا التباين الملحوظ، المعروضة في هذا البلاغ تعليمة خطوة بخطوة شاملة لإعداد وتجهيز DBS أن تستخدمها في تحديدكم والتقنيات الجزيئية وتقييمها فيما يتعلق بفعالية للكشف عن علامات الإصابة بالتهاب، سي، وفيروس نقص المناعة البشرية. المناقشة التالية هي أساسا التركيز على الخطوات المختلفة للبروتوكول المقترح.

في تاريخ DBS اختبار ورقة تصفية مختلفة العديد من بطاقات تستخدم² ولكن اليوم سوى اثنين من مصادر تجارية تحظى بموافقة إدارة الأغذية والعقاقير كالفئة الثانية الأجهزة الطبية لجمع الدم^{5، 16}. أنظمة بطاقة تصفية هذه الغاية موحدة ويكون استيعاب خصائص مشابهة جداً بحيث لا تختلف النتائج التحليلية التي تم الحصول عليها من الدم الشعرية التي أعدت في أي منهما بأكثر من 4%-5%²⁸. وليس من المستغرب، ماسسيوترا وزملاء العمل²⁹ ولذلك تم الكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 “الجيش الملكي النيبالي” جيدا على قدم المساواة مع تحليل نوعي بعد شطف من بطاقات جمع الدم من مصادر مختلفة. نظراً لهذه البيانات، فإنه يمكن عمليا استبعاد أن أي من التناقضات ولاحظ عند اختبار اقتران أزواج المصل/DBS لعلامات من HBV، سي وكان سببه عدوى فيروس نقص المناعة البشرية¹⁷ اختيار بطاقة تصفية وحدها. ومع ذلك، عند دقة التحديد الكمي لأكثر أمر لا غنى عنه، يعد التباين المصدر للمصدر قد لا يعتد بها وتقنيات أكثر تطورا، مثلاً، مثقب DBS (بدبس) كأسلوب ميكروسامبلينج³⁰ أو إعداد بقع المصل المجففة قد (DSS)³¹ لتطبيقها بدلاً من التقليدية DBS اختبار¹⁰.

حيث تستخدم كميات صغيرة فقط من الدم لاختبار DBS (قطره واحدة من الدم الشعرية تتكون من حوالي 50 ميليلتر)^{5، 16}، الاختلافات في حجم العينة الحاسمة، ومن المسلم به أن على الأقل بعض الاختلافات بين النتائج المصلية وذكر مشارك الذاتي HBV وفيروس التهاب الكبد جيم حالة سجلت خلال تجريب “دراسة دراك” تعزى إلى هذا المتغير. أهم عامل للتقليل إلى أدنى حد “تقلبات” حجم العينة هو بلا شك أسلوب صحيح لجمع الدم الشعرية، التي يمكن أن يتحقق إلا بتدريب الموظفين التقنيين²²دقيقة ومستمرة. وعلاوة على ذلك، كتدبير من تدابير مراقبة الجودة، وجميع المختبرات العاملة مع DBS ينبغي قد شرعت إجراءات لتحديد، وفي وقت لاحق باستثناء DBS العينات التي قد تعتبر غير مرضية أو غير صالح¹⁶.

دراسات تجري أساسا في سياق فيروس نقص المناعة البشرية³² وفحص الوليد³³ أظهرت أن ارتفاع نسبة الرطوبة قد يؤدي إلى تدهور لتحليلها، ولكن حتى الآن تم التوصل إلى أي توافق في الآراء بشأن مسألة كم من الوقت ينبغي أن يكون DBS الهواء المجفف . فاصل على الأقل 4 ساعة أو يفضل أن يقترح O/N في هذه الرسالة، التي اعتمدت لذلك الشروط التي استخدمت في الغالبية العظمى من جميع المنشورات ذات الصلة^{32، 34} البيانات في التخزين DBS لاستخدامها في وقت لاحق HBV وفيروس التهاب الكبد جيم اختبار تكون متعارضة. في عام 1981، وفيلا وزملاء العمل³⁵، الذي يطبق التقنيات التحليلية المعاصرة، أفادت أن التخزين في الرايت لا تؤثر نتائج التحاليل HBV أثناء فترة المراقبة كامل لمدة 180 يوما إذا كان جسم التتر > 1/1,000، ولكن ذلك DBS وأصبح الشريط الحدودي-الإيجابية أو السلبية حتى بعد 15 يوما عندما كان التتر في مصل الدم فقط 1/100. التخزين في-20 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية لم تسفر عن تحسن كبير. وفي المقابل، إجراء دراسة ثلاثين عاماً يتطابق لاحقة³⁶ اختبار عينة HBV-إيجابية، ووجد الباحثون أن مكافحة-HBc، فضلا عن الأجسام المضادة-ميزانيات كانت مستقرة ليصل إلى 183 يوما في الرايت، بينما أصبح HBsAg نفس الظروف السلبية الكاذبة فعلا بعد 63 يوما. وفيما يتعلق بالكشف عن الحمض النووي HBV من الواتس DBS، تركيز الحمض النووي الفيروسي مستقرة لمدة سبعة أيام على الأقل في³⁷ من 37 درجة مئوية أو ثبت أن “مقاومة” لتخزين في RT لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع³⁸. اختبار الأجسام المضادة لفيروس التهاب الكبد جيم-مكافحة استخدام اثنين من الجيل الثالث المتاحة تجارياً تحديدكم³⁹ تقدم نتائج دقيقة لفترة 117 يوما باستخدام عينات DBS المخزنة في-20 درجة مئوية، 2 – 8 درجة مئوية ومن 20-25 درجة مئوية، على التوالي. ومع ذلك، أدى التخزين في-20 درجة مئوية، أدنى اختلاف الكثافة البصرية. تطبيق مكافحة جيل الرابع-سي إليزا، أي، مونوليسا سي-جي-Ab-الترا، في سياق DBS اختبار، لارات et al. ⁴⁰ لوحظ انخفاض حاد في الدقة التحليلية بعد تخزين العينات DBS لأكثر من ثلاثة أيام في الرايت من ناحية أخرى، تم الحصول على نتائج اختبار دقيقة مع هذه المجموعة نفسها استخدام العينات التي أودعتها برانداو وزملاء العمل⁴¹لمدة 60 يوما تحت ظروف مختلفة (-20 درجة مئوية، 2 – 8 درجة مئوية، و 22-26 درجة مئوية). ملاحظات بشأن الانخفاض تركيزات “سي الجيش الملكي النيبالي” في DBS تحت ظروف التخزين المختلفة تتراوح بين لا تغيير كبير في الرايت لتصل إلى واحد سنة⁴² إلى تغيير عشرة إضعاف بعد أربعة أسابيع في درجة الحرارة المحيطة⁴³. أخذ هذه البيانات المتضاربة بدلاً من ذلك على الاستقرار في HBV ومولدات المضادات سي والأحماض النووية والأجسام المضادة في الاعتبار، يبدو من المعقول تتراجع في البروتوكول المقترح إلى توافق في آراء، التي تم تعريفها مسبقاً لتخزين العينات DBS ستستخدم فيروس نقص المناعة البشرية اختبار^{15، 30}: لترسب قصيرة الأجل (تصل إلى أسبوعين) مولدات المضادات، والحمض النووي الفيروسي، والأجسام المضادة تعتبر مستقرة في الرايت، بينما يتم التخزين الأمثل لفترات أطول في ظروف المجمدة.

كقاعدة عامة، ينبغي النظر المعلمات الثلاث عند تصميم بروتوكولا شطف: (1) شطف المخزن المؤقت؛ (2) المدة ودرجة الحرارة من شطف؛ و (3) حجم شطف²³. في الغالبية العظمى من جميع المنشورات ذات الصلة مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) استخدمت التينج DBS، ومعظم المؤلفين بإضافة البروتين، مثلاً، ألبومين المصل البقري (BSA) أو توين 20، خافض للتوتر السطحي، بغية تحسين إشارة المقايسة باستقرار البروتينات، كما أنها تذهب إلى الحل، وفي نفس الوقت حظر مواقع غير محددة ملزمة²³. فقط بعض التقارير، مقارنة مباشرة مخازن شطف مختلفة في سياق اختبار DBS، متاحة. فيلار et al. ³⁶، مثلاً، سجلت قدرات شطف معادل تقريبا لكافة المخازن المؤقتة استخدامها، ولكن برنامج تلفزيوني/جيش صرب البوسنة أدت إلى 0.5% في أدنى مستوى من مفاعليه غير محددة. وأدلى ملاحظة مماثلة جداً مطعمة وزملاء العمل⁴⁴ عند تطبيق مخفف عينة من “أنظمة الوراثة” رلاف تقييم الأثر البيئي شطف الأجسام المضادة-سي من DBS. نظراً لخطر تدهور العينة منخفض للغاية في الساعات الأولى بعد إعداد DBS (انظر أعلاه)، تقرر لاحتضان البقع O/N في درجة حرارة الغرفة ودعم عملية شطف بخلط النهاية أكثر لطيف. ويمتاز هذا النهج أن العينات اللكم خارج السابقة يوم يمكن مباشرة نقل للتشخيص الروتيني مبكرا صباح اليوم التالي²³. وينبغي تكييف حجم المخزن المؤقت شطف للحد الأدنى من المتطلبات الخاصة بكل منها من الاختبارات المستخدمة للتحاليل اللاحقة بغية إبقاء عامل إضعاف منخفضة قدر الإمكان. ومع ذلك، تحسين عناية الشروط شطف لكل واحد من أكثر لم يكن ممكناً في التقييم السابق سبب عينة عالية إنتاجية يجب أن تكون مضمونة في وقت قصير نسبيا خلال “دروك دراسة”¹⁷. ونتيجة لذلك، كان استخدام وحدة التخزين غير مواتية بدلاً من 1,000 ميليلتر من المخزن المؤقت المستند إلى برنامج تلفزيوني بغية استكمال عملية شطف كامل لجميع المعلمات في عمليتين منفصلتين.

يفشل هذا النهج واحد، من الناحية “تماما في نظام مكافحة-HBc/مكافحة-ميزانيات لأولئك الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية نتيجة لتركيزات منخفضة من الأجسام المضادة؛ … وأنها تتطلب إجراءات البيولوجية الجزيئية مع حساسية تحليلية الأمثل فيما يتعلق بالحمض النووي HBV واختبارات “الحمض النووي الريبي سي”. ” ¹⁷ ، من ناحية أخرى، حجم شطف عالية ثبت في أي شكل من الأشكال غير مؤات لتحديد HBsAg، سي المضادة، ومكافحة فيروس نقص المناعة البشرية بمجموعات المواد المستخدمة في التقييم. “الكشف عن مواد إيجابية من الواتس الدم كله نجح مع حساسية 98.6 في المائة إلى درجة عالية وبالمثل كما هو الحال في الدراسات السابقة، التي استخدمت في جزء وحدة تخزين شطف أصغر بكثير من 100 ميليلتر أو 250 ميليلتر، أو ميليلتر 600 أو 500 ميليلتر HBsAg”^{17 ،36، 45، 46}. حساسية 97.8 في المائة تحدد في التحقيق في 179 المصل/DBS أزواج للأجسام المضادة-سي تتفق مع النتائج الموجودة بالفعل تقارير^{24، 44، 47، 48، 49}، التي عملت مع وحدة تخزين شطف كان أقل بمقدار 5 إلى 10. “وباﻹضافة إلى ذلك، البروتوكولات للكشف عن فيروس التهاب الكبد جيم-مكافحة قد تم على النحو المناسب الأمثل… إذ ينص على نقاط وقف إنتاج المواد الانشطارية الخاصة بهم”،^{17، 24، 48، 49} “أو عن طريق زيادة حجم العينة من 20 ميكروليتر إلى 100 ميليلتر.” ^{17، 49} وأخيراً، خصوصية التحليلية وحساسية (100% كل) المنشأة للكشف عن مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية كانت مساوية أو متفوقة على خصائص الأداء لتحديدكم الأخرى على وجه التحديد تتكيف DBS اختبار^{50، 51} “أو تدريجي الإجراء مع الاستخدام المشترك للعديد من الاختبارات لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية “^17،52. “أنهم، في الواقع، كما تجاوز سجل الأداء المقايسة التي أعدت خصيصا والأمثل للكشف عن الأجسام المضادة فيروس نقص المناعة البشرية في الواتس DBS (س-منع فيروس نقص المناعة البشرية 1 + 2 طقم DBS).” ^{17, 53}  

أخذت معا، البروتوكول خطوة بخطوة شامل المعروضة في هذا البلاغ أثبت أنه أداة مجدية وسهلة الاستخدام لإعداد وتجهيز DBS و، وهكذا، يمكن استخدام موثوق في علم الفيروسات التشخيصي. يسمح نهج استخدام أتمتة ⁵⁴ ، ونظرا لخصائصها الأداء الممتاز وقد يمكن أن تكون بمثابة نوع من حجر الأساس لبروتوكول مستقبل توافق آراء مقبولة عموما في ميدان العالمية DBS التجارب في المختبرات الطب.