Kurumuş kan lekeleri - hazırlanması ve uzun ve moleküler teknikleri kullanmak için işleme

DBS 100 yıl² için kullanılmıştır ama şaşırtıcı bir şekilde, hala onların hazırlama ve işleme hakkında genel bir fikir birliği yoktur. Tüm diğer uygulamaları DBS^{5, 16, 23}test için farklı protokolleri çeşitli var ise bugüne kadar bu önemli önceden analitik faz yeterli bir standardizasyon sadece yenidoğan tarama¹⁴, alanında elde edilmiştir. Bu dikkat çekici heterojenite üstesinden gelmek için uzun ve moleküler teknikleri tarafından kullanılmak üzere hazırlama ve DBS işlemek için kullanılan bir kapsamlı adım adım talimat bu iletişimde sunulan ve etkinliği ile ilgili olarak değerlendirildi işaretleyicileri HBV, HCV ve HIV enfeksiyonları algılamak için. Aşağıdaki tartışma odağı öncelikle önerilen protokol farklı basamaklarında yer alıyor.

Birçok farklı filtre kağıdı test DBS tarihinde kartları kullanılan² olmuştur ama bugün sadece iki ticari kaynak sınıf II tıbbi cihazlar için kan toplama^{5, 16}olarak FDA tarafından onaylanan. Bu filtre kart sistemleri son derece düzgün ve böylece ikisinin de üzerinde hazırlanan kapiller kandan elde edilen analitik sonuçlar % 4-%5²⁸daha farklı değil çok benzer emme özelliklere sahip. Doğal olarak, Masciotra ve co-işçiler²⁹ bu nedenle HIV-1 RNA tespit eşit derecede kan toplama kartları farklı kaynaklardan gelen elüsyon sonra bir nitel tahlil ile iyi. Bu veriler göz önüne alındığında, bu hemen hemen herhangi bir test ederken gözlenen farklılıklar birleştiğinde işaretçileri için serum/DBS çiftlerini HBV, HCV ve HIV enfeksiyonları¹⁷ tek başına filtre kartı seçimi ile neden oldu dışlanabilir. Ancak, bir analit doğru miktar vazgeçilmez olduğunda, kaynak kaynak değişimi artık önemsiz olabilir ve daha sofistike teknikleri, örneğin, microsampling³⁰ veya hazırlık için bir yöntemi olarak DBS (PDB) delikli kurutulmuş serum lekeler (DSS)^{31 10}test geleneksel DBS yerine uygulanması gerekebilir.

Sadece az miktarda kan testi DBS için kullanıldığından (kılcal kan bir damla oluşur yaklaşık 50 µl)^{5, 16}, numune hacmi değişimler önemlidir ve itiraf etmek gerekirse, en azından bazı serolojik sonuçları arasındaki farklılıkları ve katılımcının kendi kendine bildirilen HBV ve HCV durumu “DRUCK çalışması” Pilot sırasında kaydedilen bu değişkene atfedilebilecek. “Dalgalanmalar” numune hacmi en aza indirmek için tek en önemli etken kuşkusuz sadece teknik personel²²dikkatli ve devam eden eğitim tarafından elde edilebilir kılcal kan toplama doğru bir tekniktir. Ayrıca, kalite kontrol, bir ölçüsü olarak tüm laboratuvarlar DBS ile çalışma zaten yordamlar belirlenmesi ve daha sonra yetersiz veya geçersiz¹⁶olarak dikkate alınması gereken var DBS örnekleri hariç olmak üzere başlatılan.

Öncelikle HIV³² bağlamında yürütülen çalışmalar ve yenidoğan tarama³³ yüksek nem analitler düşmesine neden olabilir, ama şimdiye kadar hiçbir fikir birliği ne kadar DBS air-dried olması gerektiği ile ilgili soru ulaşıldı göstermiştir . En az 4 saat ve tercihen bir aralığı O/N bu iletişim, bu nedenle tüm ilgili yayınları^{32, 34} veri depolama DBS büyük çoğunluğu HBV ve HCV için daha sonra kullanılmak üzere kullanılmaya başlanmıştır koşulları kabul önerilen test çakışıyor. 1981 yılında çağdaş analitik teknikler uygulamış, Villa ve co-işçiler³⁵, antikor titreleri olsaydı depolama RT, HBV analizleri sonuçlarını 180 gün tüm gözlem döneminde etkilemedi rapor > 1/1000, ama o DBS 15 gün sonra serum titreleri sadece 1/100 yaşındayken sınır-pozitif veya negatif bile oldu. Depolama Sıcaklığı-20 ° C veya 4 ° C, önemli bir gelişme sonuçlanmamıştır. Buna ek olarak, otuz yıl sonra³⁶ test HBV-pozitif örnek çoğaltır bir çalışma yaptık ve yazarlar bu anti-HBc Oysa HBsAg aynı koşullar altında olmuş anti-HBs antikor için 183 yaşam, RT, istikrarlı yanı sıra bulundu 63 gün sonra zaten yanlış negatif. DBS eluates HBV DNA algılama, ile ilgili olarak viral nükleik asit konsantrasyonu en az yedi gün 37 ° C³⁷ istikrarlı veya depolama vasıl ilâ üç haftadır RT “dayanıklı” olduğunu kanıtladı³⁸. İki piyasada bulunan üçüncü nesil uzun³⁹ doğru sonuçlar bir gün süre ile 117-20 ° C, 2-8 ° C ve 20-25 ° C, sırasıyla depolanan DBS numuneleri kullanılarak sağlanan kullanarak anti-HCV antikor testi. -20 ° c, depolama Ancak, optik yoğunluğu en düşük varyasyon sonuçlandı. Uygulama bir dördüncü nesil anti-HCV ELISA, Yani, Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, test, Larrat ve ark. DBS bağlamında ⁴⁰ analitik özgüllük üç gündür RT., DBS numuneler depolamak sonra keskin bir düşüş gözlendi Öte yandan, kesin test sonuçlar örnekleri çeşitli koşullarda (-20 ° C, 2-8 ° C ve 22-26 ° C) 60 gün boyunca Brandao ve iş⁴¹tarafından yatırılan kullanan aynı kiti ile elde edilmiştir. En çok bir yıl⁴² için hiçbir önemli değişiklik-RT, DBS HCV RNA konsantrasyonlarda çeşitli saklama koşulları altında düşüş üzerine gözlemler ortam sıcaklığı⁴³dört hafta sonra on kat bir değişim alanı. Bu oldukça çakışan veri istikrar HBV ve HCV antijenleri, nükleik asitler ve antikorlar dikkate alarak, bu daha önce için kullanılması için DBS örneklerin depolama birimi için tanımlanan bir fikir birliği için önerilen protokolündeki geri çekmek mantıklı mı geldi ^{15, 30}test HIV: daha uzun bir süre için en iyi depolama donmuş koşullar ise kısa vadeli ifade (ilâ iki hafta) için antijenleri, viral nükleik asit ve antikorlar RT, ahırda olarak kabul edilmektedir.

Bir kural olarak, üç parametre bir elüsyon Protokolü tasarlarken dikkate alınmalıdır: (1) elüsyon arabellek; (2) süresi ve elüsyon sıcaklığını; ve (3) elüsyon birim²³. Tüm ilgili yayınları büyük çoğunluğu fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) DBS eluting için kullanıldı ve çoğu yazarlar bir protein, örneğin, sığır serum albumin (BSA) veya ara 20, yüzey aktif, sabitleme ile tahlil sinyallerinin geliştirilmesi için eklendi proteinler, çözüm ve aynı anda engelleme non-spesifik bağlama siteleri²³giderken. Doğrudan farklı elüsyon arabellekleri DBS test bağlamında karşılaştırmak, sadece birkaç raporlar kullanılabilir. Villar vd. ³⁶, örneğin, hemen hemen eşdeğer elüsyon kapasiteleri, PBS/BSA kullanılan tüm arabellekleri için kaydedilen % 0.5 spesifik olmayan reaktivite düşük düzeyde sonuçlandı. Çok benzer bir gözlem Croom ve iş⁴⁴ tarafından yapılan anti-HCV antikorları elüsyon genetik sistemler rLAV ÇED numune seyreltici DBS uygularken. Örnek bozulma riski DBS (yukarı bakın) hazırlanması sonra ilk saat içinde son derece düşük olduğundan, bu noktalar O/N, ortam sıcaklığında kuluçkaya ve nazik bitti sıra karıştırılarak elüsyon işlemi desteklemek için karar verildi. Bu yaklaşım örnekler önceki yumruk avantajı vardır gün doğrudan transfer için rutin tanı erken ertesi sabah²³. Elüsyon arabellek hacmi seyreltme faktörü mümkün olduğunca düşük tutmak için daha sonraki analizler için kullanılan deneyleri en az kendi ihtiyaçlarına adapte edilmelidir. Ancak, yüksek örnek işlem hacmi nispeten kısa sürede sırasında “DRUCK çalışması”¹⁷garanti çünkü elüsyon koşullar tek her analit için dikkatli bir optimizasyon önceki değerlendirilmesinde mümkün değildi. Sonuç olarak, 1.000 µl PBS tabanlı arabellek oldukça olumsuz hacmi için iki ayrı işlem tüm parametreleri tüm elüsyon işlemini tamamlamak için kullanıldı.

Bu yaklaşım bir yandan “tamamen anti-HBc/anti-HBs sistemi nedeniyle düşük antikor konsantrasyonları; HIV ile enfekte kişilerin için başarısız … ve HBV DNA ile ilgili olarak en iyi analitik hassasiyetle moleküler biyolojik yordamları gerekli ve HCV RNA sınar. ” ¹⁷ Öte yandan, yüksek elüsyon birim hiçbir şekilde HBsAg, anti-HCV ve Anti-HIV değerlendirme kullanılan kitleri tarafından belirlenmesi için dezavantajlı olduğunu kanıtladı. “HBsAg pozitif tam kan eluates malzemelerden başarılı %98.6 100 µl, 250 µl veya 600 µl veya 500 µl çok daha küçük bir elüsyon hacmi kısmen kullanmış olduğu önceki çalışmalarda olduğu gibi aynı şekilde yüksek derecede bir hassasiyetle tespiti”^{17 ,36, 45, 46}. %97,8 179 serum/DBS çiftleri soruşturmada anti-HCV antikorları zaten var olan sonuçlarını denk için belirlenen duyarlılığını 5-10 kat daha düşük bir elüsyon birimdeki çalıştı^{24, 44, 47, 48, 49}, raporlar. “Ayrıca, anti-HCV algılama protokollerde uygun şekilde… kendi kesme noktaları ana tarafından optimize edilmiştir”^{17, 24, 48, 49} “veya 20 µl 100 µl örnek birimlere artırarak.” ^{17, 49} son olarak, analitik özgüllük ve Anti-HIV algılama için kurulan duyarlılık (% 100 her) eşit veya^{50, 51} test DBS için özel olarak uyarlanmış diğer uzun performans özelliklerinin daha üstün “veya bir kademeli yordamı birkaç Anti-HIV testleri kombine kullanımı ile”^17,52. “Onlar, gerçekten de, aynı zamanda performans göstermiş özel olarak geliştirilmiş ve DBS eluates (Q önlemek HIV 1 + 2 DBS kiti) Anti-HIV antikor tespiti için optimize edilmiş bir testin aşıldı.” ^{17, 53}  

Birlikte ele alındığında, bu iletişimde sunulan kapsamlı adım adım Protokolü hazırlama ve DBS işleme için mümkün ve kullanıcı dostu bir araç olduğu ortaya çıktı ve böylece, güvenilir bir şekilde tanı Viroloji kullanılabilir. Otomasyon ⁵⁴ kullanarak yaklaşımlar sağlar ve mükemmel performans özellikleri nedeniyle bir tür için bir gelecek genel kabul gören uzlaşma protokol DBS laboratuarda test küresel alandaki temel taşı olarak hizmet potansiyeline sahiptir Tıp.