Manchas de sangue seco - preparação e processamento para uso em imunoensaios e em técnicas moleculares

DBS têm sido utilizados para 100 anos² , mas, surpreendentemente, há ainda não há consenso geral sobre a sua preparação e processamento. Até à data, uma padronização suficiente desta importante fase pré-analítica só foi alcançada no campo de teste do pezinho¹⁴, Considerando que existe uma variedade de diferentes protocolos, para todos os outros aplicativos do ADO teste^{5, 16, 23}. Para superar esta heterogeneidade notável, uma instrução passo a passo abrangente para preparação e processamento de DBS para ser utilizada em imunoensaios e por técnicas moleculares é apresentada na presente comunicação e avaliada no que respeita à sua eficácia para a detecção de marcadores de HBV, HCV e HIV e infecções. O foco da discussão a seguir é colocado principalmente sobre as diferentes etapas do protocolo sugerido.

Na história da DBS teste de papel de filtro diferente muitos cartões foram usados² mas hoje somente duas fontes comerciais são aprovadas pelo FDA como dispositivos médicos da classe II para coleta de sangue a^{5, 16}. Esses sistemas de cartão de filtro são altamente uniformes e têm características muito semelhantes de absorção para que os resultados analíticos obtidos de sangue capilar, preparado em qualquer um deles não diferem em mais de 4%-5%²⁸. Não surpreendentemente, Masciotra e cooperadores do²⁹ , portanto, detectado o HIV-1 RNA igualmente bem com um ensaio qualitativo após eluição de cartões de coleta de sangue de diferentes fontes. Tendo em conta estes dados, pode praticamente excluir-se que qualquer das discrepâncias observadas quando o teste acoplado pares de soro/DBS para marcadores do VHB, VHC e HIV infecções¹⁷ foi causado pela escolha da placa-filtro sozinha. No entanto, quando a quantificação exata de um analito é indispensável, variação de fonte de fonte já não pode ser insignificante e técnicas mais sofisticadas, por exemplo, perfurado DBS (PDBS) como um método para microsampling³⁰ ou a preparação de manchas secas soro (DSS)³¹ pode ter que ser aplicada em vez de DBS convencional teste¹⁰.

Uma vez que apenas pequenas quantidades de sangue são utilizadas para testes de DBS (uma gota de sangue capilar consiste de cerca de 50 µ l)^{5, 16}, as variações no volume da amostra são cruciais e, reconhecidamente, ao menos algumas das discrepâncias entre os resultados serológicos e do participante auto-relatada VHB e VHC status registrado durante a pilotagem do “Estudo DRUCK” são atribuíveis a essa variável. O fator mais importante para minimizar “flutuações”, volume da amostra, sem dúvida, é uma técnica correta de coleta de sangue capilar, que só pode ser conseguida pela cuidadosa e em curso de formação do pessoal técnico²². Além disso, como medida de controle de qualidade, todos os laboratórios que trabalham com DBS devem já iniciou procedimentos para identificar e posteriormente, excluindo as amostras que devem ser considerados como insatisfatórios ou inválido¹⁶DBS.

Estudos realizados principalmente no contexto do HIV³² e teste do pezinho³³ têm mostrado que a alta umidade pode conduzir a uma degradação dos analitos, mas até agora não tem um consenso quanto à questão de quanto tempo o DBS devem ser secas ao ar . Um intervalo pelo menos 4 horas ou, de preferência O/N é proposto na presente comunicação, que adotou, portanto, condições que foram usadas na maioria de todas as publicações relevantes^{32, 34} dados no armazenamento de DBS para ser usada posteriormente para HBV e HCV teste estão em conflito. Em 1981, Villa e colegas de trabalho de³⁵, aplicaram técnicas analíticas contemporâneas, relatou que armazenamento em RT não afetou os resultados das análises de VHB durante o período de observação inteira de 180 dias, se anticorpos foram > 1/1.000, mas esse DBS tornou-se a fronteira-positivo ou negativo mesmo depois de 15 dias, quando a concentração no soro foram apenas 1/100. Armazenamento a-20 ° C ou 4 ° C não resultou em uma melhoria substancial. Em contraste, um estudo realizado mais tarde³⁶ testado Replica de uma amostra de HBV positivo de trinta anos, e os autores encontraram que anti-HBc, bem como anticorpos anti-HBs eram estáveis até 183 dias no RT, Considerando que se tornou HBsAg nas mesmas condições falso-negativos já depois de 63 dias. No que se refere a deteção de HBV DNA de eluídos DBS, a concentração do ácido nucleico viral foi estável durante pelo menos sete dias a 37 ° C³⁷ ou provou para ser “resistente” ao armazenamento em RT por até três semanas³⁸. Testes para anticorpos anti-HCV usando dois comercialmente disponível terceira geração imunoensaios³⁹ fornecido resultados precisos para um período de 117 dias usando DBS amostras conservadas a-20 ° C, 2 – 8 ° C e 20-25 ° C, respectivamente. Armazenamento a-20 º C, no entanto, resultou na menor variação de densidades ópticas. Aplicação de uma quarta geração anti-HCV ELISA, ou seja, Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, no contexto da DBS testes, Larrat et al ⁴⁰ , observada uma diminuição acentuada na especificidade analítica após armazenar as amostras DBS por mais de três dias no RT Por outro lado, resultados de testes precisos foram obtidos com o mesmo kit utilizando amostras depositadas por 60 dias sob diferentes condições (-20 ° C, 2 – 8 ° C e 22 a 26 ° C) por Brandão e cooperadores⁴¹. Observações sobre o declínio das concentrações de HCV RNA em DBS sob diferentes condições de armazenamento variam de nenhuma alteração significativa no RT por até um ano⁴² para variar dez vezes após quatro semanas em temperatura ambiente⁴³. Tendo esses dados bastante conflitantes sobre a estabilidade do VHB e VHC antígenos, ácidos nucleicos e anticorpos em conta, parecia razoável retrair no protocolo proposto para um consenso, que foi definido anteriormente para o armazenamento de amostras DBS a ser usado para HIV testes^{15, 30}: para deposição de curto prazo (até duas semanas) do ácido nucleico viral, antígenos e anticorpos são considerados como estável na RT, considerando ideal armazenamento por períodos mais longos é em condições congeladas.

Como regra geral, três parâmetros devem ser considerados ao projetar um protocolo de eluição: (1) o tampão de eluição; (2) a duração e a temperatura de eluição; e (3) o volume de eluição²³. Na grande maioria de todas as publicações relevantes tampão fosfato salino (PBS) foi usado para eluição DBS, e a maioria dos autores adicionou uma proteína, por exemplo, albumina de soro bovino (BSA) ou Tween 20, um surfactante, a fim de melhorar o sinal de ensaio por estabilização proteínas, como eles vão para a solução e simultaneamente bloqueio inespecificas sites²³. Apenas alguns relatórios, que comparam diretamente os buffers de eluição diferente no contexto do teste de DBS, estão disponíveis. Villar et al ³⁶, por exemplo, gravou quase equivalente de eluição das capacidades de todos os buffers usados, mas PBS/BSA 0,5% resultou em nível mais baixo de reatividade inespecífica. Uma observação muito similar foi feita por Croom e cooperadores⁴⁴ ao aplicar o diluente de amostra de rLAV a genética sistemas EIA para a eluição de anticorpos anti-HCV de DBS. Uma vez que o risco de degradação da amostra é extremamente baixo nas primeiras horas após preparação de DBS (veja acima), foi decidido para incubar as manchas O/N a temperatura ambiente e a apoiar o processo de eluição misturando gentil extremidade-sobre-extremidade. Essa abordagem tem a vantagem de espécimes soquei o anterior dia pode ser transferido diretamente para o diagnóstico de rotina no início da próxima manhã²³. O volume de tampão de eluição deverá ser adaptado para os respectivos requisitos mínimos dos ensaios utilizados para análises subsequentes, a fim de manter o fator de diluição mais baixo possível. No entanto, uma cuidado otimização das condições de eluição para cada analito único não foi possível na avaliação anterior, porque uma taxa de transferência alta amostra tinha que ser garantidos em um tempo comparativamente curto durante o “Estudo de DRUCK”¹⁷. Consequentemente, o volume um pouco desfavorável de 1.000 µ l de tampão PBS-baseado foi utilizado para completar o processo de eluição inteira para todos os parâmetros em duas operações distintas.

Esta abordagem um um lado falha “completamente no sistema de anti-HBc/anti-HBs para aqueles indivíduos infectados com o HIV devido as concentrações de anticorpos de baixa; … e exigiu procedimentos biológicos moleculares com ótima sensibilidade analítica em matéria de DNA do HBV e HCV RNA testes. ” ¹⁷ por outro lado, o volume de eluição alta provou para ser de nenhuma maneira desvantajosa para a determinação de HBsAg, anti-HCV e anti-HIV pelos kits utilizados durante a avaliação. “A detecção de HBsAg positivos materiais de sangue total eluídos sucedeu com uma sensibilidade de 98,6% para um grau elevado da mesma forma como em estudos anteriores, que em parte tinha usado um muito menor volume de eluição de 100 µ l, 250 µ l, ou 600 µ l ou 500 µ l”^{17 ,36, 45, 46}. A sensibilidade de 97,8% determinado no inquérito de 179 pares de soro/DBS para anticorpos anti-HCV correspondem aos resultados das já existentes relatórios^{24, 44, 47, 48, 49}, que havia trabalhado com um volume de eluição que foi menor por um fator de 5 a 10. “Além disso, os protocolos para a deteção de anti-HCV tinham sido devidamente optimizados… por estipular seus próprios pontos de corte”,^{17, 24, 48, 49} “ou aumentando os volumes de amostra de 20 µ l a 100 µ l.” ^{17, 49} -finalmente, a especificidade analítica e sensibilidade (100% cada) estabelecido para a deteção de anti-HIV foram iguais ou superiores para as características de desempenho de outros imunoensaios especificamente adaptados para DBS teste^{50, 51} “ou um passo a passo procedimento com o uso combinado de vários testes de anti-HIV”^17,52. “Eles, na verdade, também excederam o registro de desempenho de um ensaio que foi especialmente desenvolvido e otimizado para a detecção de anticorpos anti-HIV em eluídos DBS (Q-prevenir HIV 1 + 2 kit de DBS).” ^{17, 53}  

Tomados em conjunto, o protocolo passo a passo completo apresentado na presente comunicação provou para ser uma ferramenta viável e user-friendly para preparação e processamento de DBS e pode, portanto, ser usado confiantemente em virologia diagnóstica. Permite abordagens usando automação ⁵⁴ e devido às suas características de desempenho excelente, tem o potencial de servir como uma espécie de fundação-pedra para um protocolo de futuro consenso geralmente aceites no campo global de DBS, testes em laboratório medicina.