Macchie di sangue essiccato - preparazione ed elaborazione per l'uso in test immunologici e tecniche molecolari

DBS sono stati utilizzati per 100 anni² ma, sorprendentemente, non ci è ancora consenso generale sulla loro preparazione e l’elaborazione. Ad oggi, una sufficiente standardizzazione di questa importante fase pre-analitica è stata conseguita solo in materia di screening neonatale¹⁴, considerando che esiste una varietà di diversi protocolli per tutte le altre applicazioni di DBS test^{5, 16, 23}. Per superare questa eterogeneità notevole, una completa istruzione dettagliata per la preparazione e l’elaborazione di DBS per essere utilizzato nei immunoassays e mediante tecniche molecolari è presentata nella presente comunicazione e valutata per quanto riguarda la sua efficacia per la rilevazione di marcatori d’infezione da HBV, HCV e HIV. L’obiettivo della discussione seguente è posto principalmente sulle diverse fasi del protocollo suggerito.

Nella storia della DBS test molti diversi filtro carta carte sono state usate² ma oggi solo due fonti commerciali sono approvati dalla FDA come dispositivi medici di classe II per la raccolta di sangue^{5, 16}. Questi sistemi di carta filtro sono altamente uniformi e abbiano caratteristiche di assorbimento molto simili, in modo che i risultati analitici ottenuti da sangue capillare preparato su una di esse non differiscono di oltre il 4%-5%²⁸. Non sorprendentemente, Masciotra e colleghi di lavoro²⁹ pertanto rilevato HIV-1 RNA ugualmente bene con un dosaggio qualitativo dopo eluizione da schede di raccolta di sangue da diverse fonti. Dato questi dati, si può praticamente escludere che qualsiasi delle discrepanze osservate durante il test accoppiato coppie siero/DBS per marcatori dell’HBV, HCV e HIV infezioni¹⁷ è stata causata dalla scelta della carta filtro da solo. Tuttavia, quando è indispensabile accurata quantificazione di un analita, source-to-source variazione non potrebbe essere più trascurabile e tecniche più sofisticate, per esempio, perforato DBS (PDB) come un metodo per Microcampionamento³⁰ o la preparazione delle macchie secche del siero (DSS)³¹ potrebbe essere necessario applicare al posto del convenzionale DBS test¹⁰.

Poiché solo piccole quantità di sangue sono usate per DBS test (una goccia di sangue capillare è costituita da circa 50 µ l)^{5, 16}, variazioni del volume di campione sono essenziali e, devo ammettere che, in almeno alcune delle discrepanze tra i risultati sierologici e del partecipante auto-riferito stato HBV e HCV, registrato durante il pilotaggio dello “Studio DRUCK” sono attribuibili a questa variabile. Il singolo fattore più importante per ridurre al minimo le “fluttuazioni” il volume del campione è senza dubbio una tecnica corretta di prelievo di sangue capillare, che può essere raggiunto solo da un’attenta e costante formazione del personale tecnico²². Inoltre, come misura di controllo di qualità, tutti i laboratori che lavorano con DBS dovrebbero già avviato le procedure per l’identificazione e successivamente escluse esemplari DBS che devono essere considerati come insoddisfacente o non valido¹⁶.

Gli studi condotti principalmente nel contesto dell’HIV³² e screening neonatale³³ hanno dimostrato che alta umidità può portare ad un degrado degli analiti, ma finora nessun consenso è stato raggiunto per quanto riguarda la questione di quanto tempo DBS dovrebbe essere asciugato ad aria . Un intervallo di almeno 4 ore o preferibilmente O/N è proposto nella presente comunicazione, che ha pertanto adottato condizioni che sono state utilizzate nella stragrande maggioranza di tutte le pubblicazioni pertinenti^{32, 34} dati su storage di DBS per essere utilizzati successivamente per HBV e HCV test sono in conflitto. Nel 1981, Villa e colleghi di lavoro³⁵, che ha applicato le tecniche analitiche contemporanee, ha riferito che deposito presso RT non ha influenzato i risultati delle analisi HBV durante l’intero periodo di osservazione di 180 giorni se titoli dell’anticorpo erano > 1/1.000, ma quel DBS è diventato borderline-positiva o addirittura negativo dopo 15 giorni quando i titoli nel siero erano solo 1/100. Conservazione a-20 ° C o a 4 ° C non ha provocato un miglioramento notevole. Al contrario, uno studio condotto trent’anni più tardi³⁶ testato replica di un campione di HBV-positivi, e gli autori hanno trovato che anti-HBc così come gli anticorpi anti-HBs erano stabili fino a 183 giorni a RT, mentre è diventato HBsAg alle stesse condizioni falso-negativo già dopo 63 giorni. Per quanto riguarda la rilevazione del DNA di HBV da eluati DBS, la concentrazione dell’acido nucleico virale è stato stabile per almeno sette giorni a 37 ° C³⁷ o ha dimostrato di essere “resistenti” al deposito presso RT fino a tre settimane³⁸. Test per anticorpi anti-HCV utilizzando due terza generazione disponibili in commercio test immunologici³⁹ fornito risultati accurati per un periodo di 117 giorni utilizzando DBS campioni conservati a-20 ° C, 2 – 8 ° C e 20 – 25 ° C, rispettivamente. Conservazione a-20 ° C, tuttavia, ha provocato la minima variazione di densità ottica. L’applicazione di una quarta generazione anti-HCV ELISA, cioè, Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, nel contesto della DBS test, Larrat et al. ⁴⁰ osservata una drastica riduzione nella specificità analitica dopo la memorizzazione gli esemplari DBS per più di tre giorni a TA. D’altra parte, precisi risultati della prova sono stati ottenuti con lo stesso kit che utilizzano campioni depositati per 60 giorni in varie condizioni (-20 ° C, 2 – 8 ° C e 22 – 26 ° C) da Brandao e co-lavoratori⁴¹. Osservazioni sul declino delle concentrazioni di RNA di HCV in DBS in varie condizioni di deposito variano da nessuna alterazione significativa a RT per fino a un anno⁴² a un cambiamento dieci volte dopo quattro settimane a temperatura ambiente⁴³. Prendendo questi dati piuttosto contrastanti sulla stabilità dell’HBV e HCV antigeni, acidi nucleici e anticorpi in considerazione, è sembrato ragionevole per ritrarre in proposta di protocollo per un consenso, che è stata definita in precedenza per il deposito degli esemplari DBS da utilizzarsi per HIV test^{15, 30}: per deposizione a breve termine (fino a due settimane) gli antigeni, acido nucleico virale e gli anticorpi sono considerati come stalla di RT, considerando che congelate condizioni ottimali di conservazione per periodi più lunghi.

Come regola, tre parametri da considerare durante la progettazione di un protocollo di eluizione: (1) il buffer di eluizione; (2) la durata e la temperatura di eluizione; e (3) il volume di eluizione²³. La stragrande maggioranza di tutte le pubblicazioni pertinenti tampone fosfato salino (PBS) è stato usato per eluizione DBS, in maggior parte dei autori hanno aggiunto una proteina, per esempio, albumina di siero bovino (BSA) o Tween 20, un tensioattivo, al fine di migliorare il segnale del dosaggio stabilizzando proteine, come vanno in soluzione e contemporaneamente blocco di siti di legame non specifico²³. Soltanto alcuni rapporti, che confrontano direttamente il buffer di eluizione diverse nel contesto della DBS test, sono disponibili. Villar et al. ³⁶, per esempio, registrato capacità di eluizione quasi equivalenti per tutti i buffer usati, ma PBS/BSA 0.5% ha provocato il più basso livello di reattività aspecifica. Un’osservazione molto simile è stata fatta da Croom e colleghi di lavoro⁴⁴ quando si applica il diluente della genetica sistemi rLAV EIA per l’eluizione di anticorpi anti-HCV da DBS. Poiché il rischio di degradazione del campione è eccessivamente basso nelle prime ore dopo la preparazione della DBS (Vedi sopra), è stato deciso per incubare le macchie O/N a temperatura ambiente e a sostenere il processo di eluizione di miscelazione delicata estremità sopra. Questo approccio ha il vantaggio che gli esemplari perforati con il precedente giorno possa essere trasferito direttamente per la diagnostica di routine presto la mattina successiva²³. Il volume di tampone di eluizione dovrebbe essere adattato ai minimi requisiti rispettivi dosaggi utilizzati per analisi successive al fine di mantenere il fattore di diluizione più bassa possibile. Tuttavia, un’attenta ottimizzazione delle condizioni di eluizione per ogni singolo analita non era possibile nella valutazione precedente perché un throughput elevato campione doveva essere garantito in un tempo relativamente breve durante il “DRUCK studio”¹⁷. Di conseguenza, il volume piuttosto sfavorevole di 1.000 µ l di tampone PBS-base è stato utilizzato al fine di completare il processo di eluizione intero per tutti i parametri in due operazioni distinte.

Questo approccio uno una parte non riesce “completamente nel sistema anti-HBc/anti-HBs per quegli individui infettati con l’HIV a causa delle concentrazioni di anticorpi Bassi; … e ha richiesto procedure biologiche molecolari con sensibilità analitica ottimale per quanto riguarda il DNA di HBV e HCV RNA test. ” ¹⁷ d’altra parte, il volume di eluizione elevato dimostrato di essere in alcun modo svantaggioso per la determinazione di HBsAg, anti-HCV e anti-HIV di kit utilizzato durante la valutazione. “La rilevazione dell’HBsAg positivi materiali da sangue intero eluati è riusciti con una sensibilità del 98,6% ad un grado elevato allo stesso modo come in studi precedenti, che in parte aveva usato un volume di eluizione molto più piccolo di 100 µ l, 250 µ l, o 600 µ l o 500 µ l”^{17 ,36, 45, 46}. La sensibilità del 97,8% determinato nell’inchiesta di 179 coppie siero/DBS per anticorpi anti-HCV corrispondevano ai risultati già esistenti rapporti^{24, 44, 47, 48, 49}, che aveva lavorato con un volume di eluizione è stata inferiore di un fattore di 5-10. “Inoltre, i protocolli per il rilevamento di anti-HCV erano stato opportunamente ottimizzati… stabilendo i propri punti di cut-off”,^{17, 24, 48 e 49} “o aumentando i volumi di campione da 20 µ l a 100 µ l.” ^{17, 49} infine, la specificità analitica e la sensibilità (100%) stabilito per il rilevamento di anti-HIV erano pari o superiori alle caratteristiche delle prestazioni di altri test immunodiagnostici specificamente adattati per DBS test^{50, 51} “o un graduale procedura con l’uso combinato di diversi test anti-HIV”^17,52. “Essi, infatti, anche superato il record di prestazioni di un’analisi che erano stati appositamente sviluppato e ottimizzato per il rilevamento di anticorpi anti-HIV in eluati DBS (Q-prevenire l’HIV 1 + 2 kit di DBS).” ^{17, 53}  

Presi insieme, il protocollo passo-passo completo presentato in questa comunicazione ha dimostrato di essere uno strumento fattibile e facile da usare per la preparazione e l’elaborazione di DBS e, quindi, utilizzabile in modo affidabile in virologia diagnostica. Permette approcci utilizzando automazione ⁵⁴ e per le sue caratteristiche di prestazione eccellente ha il potenziale per servire come una sorta di fondamento-pietra per un protocollo futuro consenso generalmente accettati nel settore globale della DBS test in laboratorio medicina.