Getrocknete Blutflecken - Vorbereitung und Verarbeitung für den Einsatz in Immunoassays und Molekulare Techniken

DBS werden seit 100 Jahren² , aber überraschenderweise gibt es noch kein allgemeiner Konsens über die Vorbereitung und Verarbeitung. Bisher wurde eine ausreichende Standardisierung dieser wichtigen Pre-analytische Phase nur auf dem Gebiet der Neugeborenen-Screening¹⁴, erreicht eine Vielzahl von verschiedenen Protokollen besteht für alle anderen Anwendungen des DBS Tests^{5, 16, 23}. Um diese bemerkenswerte Heterogenität zu überwinden, ist eine umfassende Schritt für Schritt Anleitung für die Vorbereitung und Verarbeitung von DBS in Immunoassays und durch molekulare Techniken genutzt werden in dieser Mitteilung vorgestellt und bewertet im Hinblick auf ihre Wirksamkeit zur Erkennung von Markierungen von HBV, HCV und HIV-Infektionen. Der Fokus der folgenden Diskussion ist in erster Linie auf die verschiedenen Schritte des vorgeschlagenen Protokolls gelegt.

In der Geschichte des DBS testen viele verschiedene Filterpapier Karten wurden gebrauchte² aber heute nur zwei kommerzielle Quellen sind als Medizinprodukte der Klasse II für Blut Sammlung^{5, 16}von der FDA zugelassen. Diese Filter-Kartensysteme sind sehr einheitlich und haben sehr ähnliche Absorptionseigenschaften, so dass analytische Ergebnisse aus Kapillarblut vorbereitet auf eine von ihnen unterscheiden sich nicht von mehr als 4 – 5 %²⁸. Nicht überraschend, Masciotra und Mitarbeiter²⁹ daher erkannt HIV-1-RNA nach Elution von Blut Sammlung Karten aus verschiedenen Quellen mit ein qualitatives Assay gleichermaßen gut. Angesichts dieser Daten, kann es praktisch ausgeschlossen werden, dass jeder die Unterschiede beobachtet, beim Testen Serum/DBS-Paare für Markierungen von HBV, HCV gekoppelt und HIV Infektionen¹⁷ durch die Wahl der Filterkarte allein verursacht wurde. Wenn genaue Quantifizierung eines Analyten unabdingbar ist, Quelle-Source Variation kann nicht mehr vernachlässigbar sein und immer raffiniertere Techniken, z.B.perforiert DBS (PDBS) als eine Methode zur Microsampling³⁰ oder die Vorbereitung der getrocknete Serum Spots müssen (DSS)³¹ anstelle von herkömmlichen DBS¹⁰Tests angewendet werden.

Da nur kleine Mengen Blut für DBS Tests verwendet werden (ein Tropfen Kapillarblut besteht aus etwa 50 µl)^{5, 16}, Variationen in das Probenvolumen sind entscheidend und, zugegeben, um zumindest einige der Unterschiede zwischen serologischen Ergebnisse und des Teilnehmers selbst berichtet HBV und HCV Status während der Pilotphase der “DRUCK-Studie” entfallen auf diese Variable. Der wichtigste Faktor zur Minimierung der “Schwankungen” das Probenvolumen ist zweifellos eine korrekte Technik der kapillare Blutentnahme, die nur durch sorgfältige und Weiterbildung von Fachpersonal²²erreicht werden kann. Darüber hinaus als Maß für die Qualitätskontrolle, sollte alle Labore arbeiten mit DBS bereits eingeleiteten Verfahren zur Identifizierung und anschließend ohne DBS-Exemplare, die als unbefriedigend oder ungültige¹⁶berücksichtigt werden.

Studien in erster Linie im Zusammenhang mit HIV³² und Neugeborenen-Screening³³ haben gezeigt, dass hoher Luftfeuchtigkeit führen zu einem Abbau des Analyten, aber bisher kein Konsens erreicht wurde, hinsichtlich der Frage, wie lange DBS luftgetrocknet werden sollte . Ein Intervall von mindestens 4 Stunden oder vorzugsweise O/N wird in dieser Mitteilung, die daher Bedingungen angenommen, die in der überwiegenden Mehrheit aller relevanten Publikationen^{32, 34} Daten im Speicher des DBS verwendet wurden, um anschließend für HBV und HCV verwendet werden vorgeschlagen testen sind widersprüchlich. Im Jahr 1981, Villa und Mitarbeitern³⁵, die zeitgenössischen analytischen Techniken angewandt, berichtet, dass Lagerung bei RT nicht die Ergebnisse der HBV-Analysen während des gesamten Beobachtungszeitraums von 180 Tagen beeinflussen wären Antikörpertiter > 1/1.000, aber diese DBS nach 15 Tage als Titer im Serum nur 1/100 waren wurde grenzwertig positiv oder auch negativ. Lagerung bei-20 ° C oder 4 ° C hat keine wesentliche Verbesserung geführt. Im Gegensatz dazu eine Studie durchgeführt, dreißig Jahre später³⁶ getestet einer HBV-Positive Probe repliziert, und die Autoren, dass Anti-HBc sowie Anti-HBs-Antikörper bis zu 183 Tage bei RT, stabil blieben, während HBsAg unter den gleichen Bedingungen wurde gefunden falsch-Negative bereits nach 63 Tagen. Im Hinblick auf HBV-DNA-Erkennung von DBS Eluate, die Konzentration der viralen Nukleinsäure wurde für mindestens sieben Tage bei 37 ° C³⁷ stabil oder erwies sich als “resistent” gegen Lagerung bei RT für bis zu drei Wochen³⁸. Prüfung auf Anti-HCV-Antikörper mit zwei handelsüblichen dritten Generation zur Verfügung gestellten Immunoassays³⁹ genaue Ergebnisse für einen Zeitraum von 117 Tage mit DBS Proben bzw. bei-20 ° C, 2 – 8 ° C und 20 – 25 ° C gelagert. Lagerung bei-20 ° C, führten jedoch die niedrigste Variation der optischen Dichte. Anwenden einer vierten Generation Anti-HCV ELISA, d. h. Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, im Rahmen des DBS testen, Larrat Et Al. ⁴⁰ beobachtet einen starken Rückgang der analytischen Spezifität nach Speicherung DBS Proben länger als drei Tage bei RT Auf der anderen Seite wurden präzise Testergebnisse mit dem gleichen Kit Nutzung hinterlegte für 60 Tage unter verschiedenen Bedingungen (-20 ° C, 2 – 8 ° C und 22 – 26 ° C) von Brandao und Mitarbeiter⁴¹Proben erhalten. Beobachtungen auf dem absteigenden Ast der HCV-RNA-Konzentrationen im DBS unter verschiedenen Bedingungen reichen von keine signifikante Änderung bei RT für bis zu einem Jahr⁴² zu einem zehnfachen nach vier Wochen bei Umgebungstemperatur⁴³. Unter diesem eher widersprüchlichen Daten zur Stabilität des HBV und HCV-Antigene, Nukleinsäuren und Antikörper zu berücksichtigen, schien es sinnvoll, in das vorgeschlagene Protokoll zu einem Konsens zurückziehen, die früher zur Lagerung von DBS Exemplare für zu verwendende definiert wurde HIV-Test^{15, 30}: für kurzfristige Ablagerung (bis zu zwei Wochen) Antigene, virale Nukleinsäure und Antikörper sind als stabil betrachtet bei RT, während gefrorene Bedingungen optimaler Lagerung für längere Zeit steht.

In der Regel drei Parameter betrachtet werden, bei der Gestaltung einer Elution Protokolls: (1) der Elution Puffer; (2) die Dauer und Temperatur der Elution; (3) der Elution Volume²³. In der überwiegenden Mehrheit aller relevanten Publikationen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) diente eluierenden DBS, und die meisten Autoren hinzugefügt, ein Protein, z.B., Rinderserumalbumin (BSA) oder Tween 20, ein Tensid, um das Assay-Signal durch die Stabilisierung zu verbessern Proteine, wie sie in Lösung und gleichzeitig blockierende unspezifischen Bindung Seiten²³gehen. Nur ein paar Berichte, die verschiedene Elution Puffer im Rahmen des DBS testen direkt vergleichen zu können, stehen zur Verfügung. Villar Et al. ³⁶, z. B.erfasst fast gleichwertige Elution Kapazitäten für alle Puffer verwendet, aber PBS/BSA 0,5 % resultierte in der untersten Ebene der unspezifische Reaktivität. Eine sehr ähnliche Beobachtung erfolgte durch Croom und Kollegen⁴⁴ bei der Anwendung der Probe Verdünnungsmittel von Genetik Systeme rLAV UVP für die Elution von Anti-HCV-Antikörper von DBS. Da das Risiko einer Verschlechterung der Probe in den ersten Stunden nach der Zubereitung des DBS (s.o.) äußerst gering ist, wurde es beschlossen, die Spots O/N bei Raumtemperatur inkubieren und zur Elution durch schonendes Mischen über durchgängige Unterstützung. Dieser Ansatz hat den Vorteil, die den vorherigen Proben ausgestanzt Tag ist direkt übertragbar Routinediagnostik früh am nächsten Morgen²³. Das Volumen des Puffers Elution sollten an die jeweiligen Mindestanforderungen der Assays für spätere Analysen verwendet, um den Verdünnungsfaktor so gering wie möglich zu halten angepasst werden. Eine sorgfältige Optimierung der Elution Bedingungen für jede einzelne Analyten war jedoch nicht in der vorhergehenden Bewertung möglich, weil ein hoher Probendurchsatz musste während der “DRUCK-Studie”¹⁷in vergleichsweise kurzer Zeit gewährleistet sein. Infolgedessen wurde der eher ungünstige Volumen von 1.000 µl PBS-Puffer verwendet, um die ganze Elution für alle Parameter in zwei separate Vorgänge abzuschließen.

Diesen Ansatz scheitert einerseits “komplett in das Anti-HBc/Anti-HBs-System für diejenigen Personen, die mit HIV infiziert, aufgrund der niedrigen Antikörper-Konzentrationen; … und es benötigt molekularen biologischen Verfahren mit optimaler analytische Empfindlichkeit in Bezug auf HBV-DNA und HCV-RNA-tests. ” ¹⁷ auf der anderen Seite erwies sich das hohe Elution Volumen in keiner Weise nachteilig für die Bestimmung von HBsAg, Anti-HCV und Anti-HIV durch die Kits in der Bewertung verwendet. “Der Nachweis von HBsAg-positiven Materialien aus Vollblut Eluaten ist es gelungen, mit einer Empfindlichkeit von 98,6 % ähnlich stark wie in früheren Studien, die teilweise ein viel kleineres Elution Volumen 100 µl, 250 µl oder 600 µl oder 500 µl verwendet hatte”^{17 ,36, 45, 46}. Die Empfindlichkeit von 97,8 % bestimmt bei der Untersuchung von 179 Serum/DBS-Paare für Anti-HCV-Antikörper zu den Ergebnissen der bereits bestehenden entsprach Berichte^{24, 44, 47, 48, 49}, die mit einem Elution Volumen gearbeitet hatten, die um den Faktor 5 bis 10 niedriger war. “Darüber hinaus hatte die Protokolle für Anti-HCV-Erkennung entsprechend optimiert, indem Sie ihre eigenen Cut-off-Punkte festlegen…”,^{17, 24, 48, 49} “oder durch die Erhöhung der Probenvolumen von 20 µl bis 100 µl.” ” ^{17, 49} schließlich die analytische Spezifität und Sensitivität (100 %) für Anti-HIV-Erkennung festgelegt wurden, größer oder gleich zu den Leistungsmerkmalen von anderen Immunoassays speziell auf DBS testen,^{50, 51} “oder eine schrittweise Verfahren mit dem kombinierten Einsatz von mehreren Anti-HIV-Tests”^17,52. “sie, übertroffen in der Tat auch der Leistungsnachweis eine Probe, die hatte speziell entwickelt und optimiert für den Nachweis von Anti-HIV-Antikörpern im DBS Eluate (Q-verhindern, dass HIV 1 + 2 DBS-Kit).” ” ^{17, 53}  

Zusammen genommen, das umfassende Schritt für Schritt Protokoll dieser Mitteilung erwies sich als ein machbar und benutzerfreundliches Werkzeug für die Erstellung und Verarbeitung von DBS und kann somit zuverlässig in der diagnostischen Virologie verwendet werden. Es ermöglicht Ansätze mit Automatisierung ⁵⁴ und aufgrund ihrer ausgezeichneten Leistungsmerkmale hat das Potenzial, als eine Art der Grundstein für eine zukünftige allgemein anerkannten Konsens-Protokoll im globalen Bereich der DBS Tests im Labor dienen Medizin.