JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingeniería

صالحة قابل للغلق غرفة فيمتولتر مجانا خلية علم الأحياء

Published: March 11, 2015
doi:
10.3791/52616
, , , , , ,
1Bredesen Center,University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Nanophase Materials Sciences,Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Materials Science and Engineering,University of Tennessee, Knoxville

Summary

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Abstract

توفر أنظمة خالية من خلية منصة مرنة لبحث شبكات معينة من التفاعلات البيولوجية معزولة عن تقاسم الموارد معقدة (على سبيل المثال، التعبير الجيني العالمي، الانقسام الخلوي) واجه داخل الخلايا الحية. ومع ذلك، فإن هذه الأنظمة، وتستخدم في المفاعلات السائبة التقليدية على نطاق والكلي، وغالبا ما تفشل لعرض السلوكيات الديناميكية والكفاءة المميزة المعيشة نظرائهم الصغيرة الحجم. فهم تأثير بنية الخلية الداخلية واسعة النطاق على ديناميات رد فعل أمر بالغ الأهمية لفهم شبكات الجينات المعقدة. نحن هنا تقرير جهاز microfabricated أن تحصر ردود الفعل خالية من الخلايا في حجم نطاق الخلوية في حين يسمح توصيف المرن للنظام الجزيئي المغلقة. هذا بولي متعدد الطبقات (dimethylsiloxane) (PDMS) جهاز يحتوي على غرف رد فعل على نطاق وفيمتولتر على غشاء من اللدائن المرنة التي يمكن دفعتها (المفتوحة والمغلقة). عندما دفعتها، غرف تحصر خلية مجاني تخليق البروتين (CFPS) ردود الفعلمعربا عن بروتين فلوري، والسماح لتصور حركية التفاعل مع مرور الوقت باستخدام الوقت الفاصل بين فلوري المجهر. نحن هنا لشرح كيف يمكن استخدام هذا الجهاز لقياس الضوضاء هيكل من ردود الفعل CFPS بطريقة غير مباشرة مماثلة لتلك المستخدمة لوصف الأنظمة الخلوية، وبالتالي تمكين استخدام تقنيات البيولوجيا الضوضاء المستخدمة في الأنظمة الخلوية لتوصيف الدوائر الجين CFPS و تفاعلاتها مع البيئة خالية من الخلايا.

Introduction

نظم خالية من الخلايا توفر منصة مبسطة ومرنة لمشاهدة ردود الفعل البيولوجية مجانا من العوامل المعقدة مثل اللياقة البدنية، والانقسام، والطفرة التي لا يمكن تجنبها في دراسة الخلايا الحية. وقد استخدمت هذه النهج لدراسة الأنظمة الخلوية بما في ذلك توصيف للبروتينات غشاء 1، وتحقق من تفاعلات البروتين 2، واستكشاف الجوانب الأساسية لترجمة 3-7. في الآونة الأخيرة بدأت أنظمة خالية من الخلايا لكسب موطئ قدم كما منصات قابلة للالبيولوجيا التركيبية 8-10. نداء من هذه النهج هو أنها سراح البيولوجيا التركيبية من تقاسم الموارد و "ضجيج خارجي" التي تؤثر على ديناميات التفاعل في الخلايا الحية. ومع ذلك تبقى التساؤلات عن كيفية البيئة المادية التي هي جزء لا يتجزأ ردود الفعل خالية من الخلايا يؤثر على تطور ونتيجة للتفاعل. رد فعل بيئات خالية من الخلايا – environm المقتصرة بالذاتلا تزال سيئة تتميز – الوالدان أن نقترب حجم الخلية ذات الصلة. خلية مجاني تخليق البروتين (CFPS) هو الفكر للأعراف من كونها "خالية من نطاق"، واظهار حركية تعادل عبر مجموعة من ميكروليتر إلى مجلدات رد فعل لتر على نطاق و-11. ومع ذلك، فقد تبين حصر ردود الفعل على كميات نطاق الخلوية تؤثر بشكل كبير معدلات البروتين التعبير (12).

طبيعة العشوائية من ردود الفعل خالية من الخلايا – وخاصة لأن هذه نهج النظم أو حتى الذهاب أدناه فيمتولتر مجلدات – قد تكون ذات أهمية خاصة. الضوضاء في التعبير الجيني هو خاصية تتأثر الى حد كبير الحبس كوحدات تخزين زنزانة صغيرة وكثافة عالية من المكونات تجبر العديد من الجزيئات الهامة إلى مستويات سكانية منخفضة للغاية – على سبيل المثال، كولاي حدود في حجم 1 FL ما يصل إلى 4،300 البروتينية مختلفة تحت سيطرة محرض من عدة مئات من المروجين مختلفة 13. وقد تورط هذا الضجيج الأصيل باعتباره القوة الدافعة المركزية في العديد من العمليات البيولوجية بما فيها الكيميائي 14، فإن قرار فيروس نقص المناعة البشرية بين تكرار نشط والكمون 15، فإن القرار λ فج بين تحلل واستذابة 16،17، وقرار العصوية subtillus بين الكفاءة وتبوغ 17. ثم يقدم البيولوجيا التركيبية خالية من الخلايا على حد سواء فرصة لاستكشاف خصائص العشوائية الدوائر الجينات الخلوية وشبكات، والتعامل مع هذه السلوكيات لتحقيق أهداف تكنولوجية محددة. في حين أن السلوك ضجيج الأنظمة الخلوية قد درست جيدا-18-27، كان هناك القليل من التنقيب عن سلوك الضوضاء الأساسي لنظم خالية من الخلايا 8، وخاصة على المستوى الخلوي.

هنا نقدم منبرا لدراسة الآثار العشوائية في علم الأحياء الاصطناعية خالية من الخلايا. تحتوي هذه المنصة microfabricated نطاق فيمتولتر رد فعل جhambers التي يمكن تحويلها بسرعة بين فتح (نشر مجانا داخل وخارج الغرفة) والمغلقة (الكواشف محصورة داخل غرفة) ولايات. في حالة مغلقة، فإننا نحصر تخليق البروتين (CFPS) الكواشف خلية مجاني تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، واتبع التعبير الجيني باستخدام الوقت الفاصل بين المجهر مضان 28 (الشكل 1). نحن نصنف هذه البيئة خالية من الخلايا عن طريق قياس هيكل التقلبات العشوائية في التعبير الجيني بطريقة مشابهة مباشرة لتلك المستخدمة لوصف الخلايا 25. أساليب غير التصنيع الدقيق لحصر ردود الفعل خالية من الخلايا وتشمل الحويصلات والجسيمات الشحمية 29-32 والمياه في النفط المستحلبات 12، وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها 33. ومع ذلك، في حين أن هذه الأساليب يمكن أن توفر السيطرة على توزيع حجم وحدات التخزين يقتصر 34، وأساليب التصنيع الدقيق خلق ميزات قابلة للتكرار للغاية مع أبعاد محددة بإحكام، حتى على مقياس النانو.وعلاوة على ذلك، يمكن تتبع هذه الهياكل الجامدة بسهولة مع مرور الوقت دون أن تكون عرضة للتبخر أو تغيرات في البيئة الخارجية. تصاميم حاوية Microfabricated المستخدمة في 8،35 العمل السابقة لا يمكن ختم بسرعة غرف رد فعل بعد بدء رد فعل، وتعقيد تحديد واضح للوقت بدأ التفاعل (الوقت صفر). باستخدام الطريقة المعروضة هنا، وهناك حاجة فقط 4-5 دقيقة بين بدء وتصور رد فعل على الجهاز، وبالتالي توفير "الوقت الصفر" واضحة المعالم. البروتوكولات التالية تصف أساليب لافتعال واختبار هذا الجهاز، بما في ذلك الطباعة الحجرية الضوئية، والتجمع الجهاز واختبار الجهاز، وطرق تحليل الصور.

Protocol

1. الطباعة الحجرية الضوئية من جهاز الماجستير يذوى رقائق السليكون نظيفة على طبق ساخن في ~ 250 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل. ملاحظة: ومن الممارسات الجيدة لاستخدام الرقاقة أكثر من واحد عند إعداد الماجستير، في حالة الخطأ المستخدم. إعداد مأخوذة مقاومة للضوء. إعداد aliquots من كل من SU-8 2015 مقاومة للضوء والتخفيف من SU-8 2015 مقاوم الضوء في 2: 1 نسبة استخدام SU-8 أرق كما مخفف. ملاحظة: 1 مل من مقاومة للضوء وهناك حاجة تقريبا لطلاء تدور واحد رقاقة. إعداد ثلاثة أنماط قناع لإنتاج هذه الماجستير. لغشاء ماستر، وإعداد اثنين من الأقنعة: واحد الزخرفة قناة الغشاء والزخرفة الأخرى غرف رد فعل. للسيد صمام التحكم، وإعداد نمط قناع واحد فقط. ملاحظة: للحصول على مزيد من التفاصيل حول تقنيات الطباعة الحجرية، بما في ذلك قناع الزخرفة، انظر إيتو وأوكازاكي، 2000. (36) انظر Fowlkes وكولير 2013 للحصول على وصف أكثر تفصيلا من تصميم جهاز 37. إعداد غشاء ماستر تدور معطف 2: 1 SU-8 2015 مقاوم الضوء التخفيف على رقائق في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية. رقائق خبز لينة على 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. باستخدام اليجنر الاتصال، وفضح رقائق مع نمط قناة الغشاء لمدة 10 ثانية، وإجراء خبز بعد التعرض لمدة 2 دقيقة في 95 ° C. تطوير رقائق في SU-8 مطور لمدة 1 دقيقة، أو حتى يتم إزالة بقايا مقاومة للضوء. شطف رقاقة مع الأيزوبروبانول، والانتقال من أعلى إلى أسفل. رقاقة جافة مع النيتروجين، والانتقال مرة أخرى من أعلى إلى أسفل. رقائق خبز على حرارة 180 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. تدور معطف منقوشة الرقائق مرة أخرى مع 2: 1 SU-8 التخفيف في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية. خبز لينة منقوشة الرقائق لمدة 2 دقيقة في 95 ° C. عن طريق الاتصال اليجنر، محاذاة رقائق منقوشة مع نمط دائرة رد الفعل، وفضح لمدة 10 ثانية. أداء بعد التعرض للخبز لمدة 2 دقيقة في 95 ° C. تطوير رقائق كما هو موضح في الخطوة 1.4.3. بعد النامية وتجفيف الرقائق، ورقائق خبز على حرارة 180 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. ملاحظة: قد يتم تطوير رقائق في نفس المطور الذي تم استخدامه في الخطوة السابقة. إعداد صمام التحكم ماستر تدور معطف مخفف SU-8 مقاومة للضوء على رقائق نظيفة في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية. لينة رقاقة خبز في 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق. باستخدام اليجنر الاتصال، وفضح رقائق مع سيطرة نمط صمام لمدة 10 ثانية. إجراء خبز بعد التعرض للفي 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق. تطوير رقائق في SU-8 المطور لمدة 2 دقيقة، أو حتى يتم إزالة بقايا. شطف مع الأيزوبروبانول، والانتقال من أعلى إلى أسفل. رقاقة جافة مع النيتروجين ويخبز على حرارة 180 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. 2. PDMS تصنيع جهاز Silanize كل سادة مع ~ 0.2 مل trimethylchlorosilane عبر ترسيب البخار. أرفق بسرعة سيد في وعاء محكم في RT مع بضع قطرات من وكيل silanizing. ملاحظة: قد يكون بروتوكولات silanizing أخرى مقبول 38 إذا يؤديها على الوجه الصحيحذ، فإن PDMS يكون من السهل إزالته. مزيج بولي التجاري (dimethylsiloxane) (PDMS) قاعدة وكيل علاج في نسب مختلفة لكل من الغشاء والسيطرة طبقات صمام للجهاز، كما ثبت في صمام متعدد الطبقات مماثل تصاميم 39. استخدام 20: 1 و 5: 1 نسب قاعدة: وكيل علاج للغشاء قوالب وصمام التحكم، على التوالي. لقالب الغشاء، مزيج 10 غرام من قاعدة مع 0.5 غرام من وكيل علاج. ملاحظة: سيتم المغلفة تدور-هذا الكتاب على سيد الغشاء. لصمام التحكم العفن، وخلط القاعدة وكيل علاج في نسبة 5: 1. كمية PDMS اللازمة لالعفن صمام التحكم سيعتمد على حاوية تستخدم لعقد سيد صمام التحكم. ملء الحاويات بحيث سيد وهي مغلفة مع ~ 1 سم من PDMS. تخلط جيدا كلا PDMS الاستعدادات، والغاز نزع لهم في فراغ الغرفة حتى لا فقاعات الهواء مرئية. وضع سيد صمام التحكم في مقاومة الحرارةحاوية، مثل طبق زجاجي. صب بعناية 5: 1 نسبة PDMS على سيد، والغاز إزالة الحاوية للمرة الثانية. في حين الحاوية صمام التحكم PDMS يتم نزع بالغاز، تدور معطف 20: 1 نسبة PDMS على الشريحة الرئيسية غشاء بصب الخليط بعناية PDMS على سيد الغشاء للحد من تشكيل فقاعة الهواء، ثم تدور طلاء على درجة الماجستير في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية. علاج جزئيا على حد سواء الماجستير في فرن عند 80 درجة مئوية لمدة 6 دقائق للسيد غشاء و 15 دقيقة للسيد صمام التحكم. ملاحظة: عندما شفي جزئيا، ينبغي أن PDMS عقد شكله، ولكن سوف تكون المادة مبتذل قليلا. إذا لم يتم علاجه PDMS بعد، خبز مرة أخرى في الزيادات من بضع دقائق في كل مرة إلى تحمل مواد شكله عند الضغط عليه. قطع PDMS قوالب مستطيلة من سيده صمام التحكم، تقشير القوالب بعيدا بلطف. لكمة ثقوب مدخل من خلال عنصر مصبوب باستخدام 0.75 ملم حفرة لكمة. ملاحظة: قد يتم تنظيف الحفرة عن طريق إدخال blun قياس 23ر طرف الإبرة، والسطح الخارجي العفن يمكن تنظيفها مع شريط السلوفان، إذا لزم الأمر. باستخدام المجهر الضوئي لتحديد الدوائر رد فعل على الشريحة الرئيسية الغشاء، محاذاة عنصر العفن صمام التحكم مع ملامح الغشاء دائرة رد الفعل ووضع المكون صمام التحكم مباشرة على رأس سيد الغشاء. توجيه مدخل صمام التحكم إلى أسفل الزاوية اليسرى من الجهاز، والتأكد من أن غرف رد فعل وقناة للسيد غشاء مرئية داخل صمام التحكم مستطيل. خبز مكونات العفن الانحياز في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. ملاحظة: سيتم الآن مختومة الغشاء والسيطرة قوالب صمام معا، والتلاعب كما العفن واحد. قطع PDMS العفن الطبقات بعيدا عن سيد الغشاء، تقشير القالب بعيدا عن سيد بلطف شديد حتى لا خرم الغشاء. لكمة مدخل ومخرج الثقوب لاستخراج خلية إدخال باستخدام 0.75 ملم حفرة لكمة. لكمة ثقوب من خلال كل من طبقات،وتنظيفها بنفس الطريقة كما هو موضح في الخطوة 2.6. باستخدام منظف بالحث يقترن البلازما، والبلازما علاج كل من العفن (الجانب غشاء متابعة) ورقم 0 الزجاج ساترة بنسبة 10.5 W لمدة 20 ثانية. على الفور إزالة ساترة والعفن من نظافة البلازما وطبقة المكونات، والجانب غشاء نحو الزجاج، في محاولة للحد من جيوب هوائية بين الزجاج والعفن. لا تضغط مباشرة على قناة المدخلات الغشاء، أو الغشاء قد يصلب على الزجاج، مما يجعل من الصعب ملء القناة مع الكواشف. عناية خاصة عند التعامل مع الأجهزة تجميعها لتجنب كسر طبقة الزجاج. استخدام coverslips الزجاج رقيقة كما يجب تصوير الجهاز من خلال ساترة الزجاج باستخدام الأهداف النفط الغمر تضخم عالية – إذا كان الزجاج سميكا جدا، وميزات الجهاز قد لا تكون مرئية. وأخيرا، وعلاج أجهزة الانتهاء في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. 3. إعداد التجريبي FOص خالية من خلية تخليق البروتين رد الفعل هيدرات جهاز به المغلي في الماء منزوع الأيونات لمدة 1 ساعة. وينبغي أن يكون جهاز مظهر غائم عندما رطب تماما: ملاحظة. ويمكن أيضا أن تترك جهاز O / N في الماء المعقم في RT من أجل ترطيب ذلك. باستخدام مجهر مقلوب مع غرفة الحضانة، ضبط درجة الحرارة المحيطة إلى 30 ° C. ملاحظة: تم اختيار هذه الحرارة لتحسين التعبير عن GFP مع المروج T7، لذلك درجات الحرارة المثلى للتفاعلات أخرى قد تختلف 40. جبل الجهاز لالمجهر حامل خشبة المسرح مع شريط السلوفان والتفاف حواف الجهاز مع المناديل الورقية المبللة من أجل الحفاظ على ترطيب المحلي. استخدام اثنين عالية الدقة حلقة مغلقة محولات الجهد الضغط لتعديل ضغط غاز النيتروجين ليشتغل صمام التحكم والمدخلات كاشف. ملاحظة: لقد فقط تم اختبار هذا البروتوكول مع المنخفض نقاء النيتروجين، على الرغم من الغازات الخاملة أخرى يمكن استخدامها. قم بتوصيل محول الأول24 عيار PTFE الأنابيب إلى خزان للمياه الذي عقد في كوب قارورة 4 مل مع غطاء الحاجز. ربط الخزان إلى مدخل صمام التحكم باستخدام أنبوب الثاني إنهاؤها قبل 23 مقياس طرف حادة الإبرة. ملاحظة: كل من أنابيب تخترق الحاجز خزان مع اثنين من الإبر قياس 23 حادة. قم بتوصيل محول الثاني بنسبة 24 عيار PTFE أنابيب متصلة الذكور إلى الذكور لور-لوك الموصل. إرفاق هذا إلى لور-لوك 23 إبرة قياس متصلة بواسطة أنابيب مع 23 مقياس طرف حادة إبرة أخرى، والتي يتم تجميعها بشكل فردي لكل جهاز. هذه الإبرة يتصل القناة رد فعل الغشاء. استخدامه لطرد المياه من القناة رد فعل والكواشف الإدخال. باستخدام البروتين نظام التعبير خالية من الخلايا وتجميع مكونات للتفاعل CFPS على الجليد، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تقليل الوقت الذي يقضيه عقد الكواشف CFPS على الجليد ووضع رد الفعل في الجهاز فورا بعد التجميع. ملاحظة: تم هذا الجهازتستخدم مع E. التجاري القولونية استخراج البروتين عدة التعبير والبلازميد معربا عن GFP جوهري. تم تحجيمها إجمالي حجم رد الفعل إلى 25 ميكرولتر – قد يكون من الممكن استخدام حتى انخفاض حجم لالكواشف، إذا رغبت في ذلك. كما الكواشف CFPS تميل إلى أن تكون حساسة لتجميد أذاب دورات، قد يكون من المفيد لجعل aliquots من الكواشف في حجم مناسب قبل التجربة. ويمكن إضافة الكواشف الأخرى إلى خليط التفاعل، ولكن يجب أن يتم تجميعها رد الفعل تماما قبل تطبيقها على الجهاز. تجميع رد فعل، مضيفا أن مدخلات DNA الماضي. ملاحظة: تجميعها مرة واحدة في أنبوب إيبندورف، وسوف يبدأ رد فعل CFPS إذا لم يعقد على الجليد. منذ ذلك الوقت اتخذت لتطبيق الكواشف إلى الجهاز والبدء قد تختلف التجربة، فإنه من المفيد لبدء الموقت مرة واحدة يتم تجميعها رد فعل ومختلطة – وهذا سيبقي الزمني بين التجارب متناسقة، والمساعدة في حل المشاكل. باستخدامأنابيب وإبرة موصل هو موضح في الخطوة 3.4.2، سحب رد فعل تجميعها في الأنبوب باستخدام حقنة 1 مل. ادخال الإبرة طرف حادة في مدخل دائرة رد الفعل. فصل موصل الإبرة من المحاقن ونعلق عليه إلى موصل الذكور إلى الذكور المستخدمة في محول دائرة رد الفعل. الضغط (<10 رطل) إلى الكواشف CFPS لملء القناة. إزالة الإبرة عندما يتم تعبئة رد فعل. إدراج أنبوب حادة من محول آخر في مدخل صمام التحكم. لا الضغط على صمام التحكم حتى الان. وضع الجهاز شنت على خشبة المسرح. باستخدام التصوير brightfield، حدد موقع غرف رد فعل مع هدف النفط الغمر 100X. تحفيز صمام التحكم بواسطة الضغط على محول صمام التحكم إلى 20 رطل لكل بوصة مربعة. سوف تغير واضح في الغشاء يكون واضحا عند دفعتها صمام التحكم. التركيز على قيعان من غرف رد فعل. بدء الحصول على الصور. النمو في مضان ثسوء تكون واضحة في الداخل وحول الخارجي للغرف رد الفعل، على الرغم من أنه من المحتمل أن لا يكون واضحا في المراحل المبكرة من رد الفعل. التقاط الصور في كل دقيقة 1-3 حتى يصل رد فعل مضان حالة مستقرة. إذا مرحلة التركيز تلقائيا غير متوفرة، إعادة تركيز لفترة وجيزة كل صورة السابقة إلى الصور التي يجري اتخاذها. ملاحظة: في حين أن بعض photobleaching من سيحدث، قد أخذها في الاعتبار التأثيرات على مضان النسبي بسبب photobleaching من لطالما معدل photobleaching من هو معروف. ويمكن تقدير هذا المعدل photobleaching من خلال تعريض معيار فلوري، مثل تركيز معروف من GFP أو خليط fluorophore، لphotobleaching من ثابتا على مدى فترة من الزمن. تسجيل الوقت المنقضي من التجمع رد فعل على الصورة الأولى المكتسبة. ملاحظة: هذا يستغرق عادة 4-5 دقيقة. 4. تحليل الصورة ومعالجة البيانات باستخدام برامج التحليل الصور مثل يماغيج، حددالداخلية للغرف رد الفعل باعتبارها ROI. الحصول على متوسط ​​قيمة كثافة مضان من العائد على الاستثمار لجميع الصور. ملاحظة: هذا هو كثافة مضان الخام أثر. تنفيذ هذه المهمة في يماغيج استخدام الإضافات مدير السلاسل الزمنية محلل وROI – استخدام السلاسل الزمنية محلل لاختيار المناطق ذات الاهتمام في جميع أنحاء المناطق الداخلية من كل دائرة رد الفعل. مجموعة "AutoROIProperties" إلى منطقة والتي تتطابق مع المناطق الداخلية من كل دائرة رد الفعل، تحقق "إضافة عند النقر"، وحدد كل غرفة. ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم هذه الخطوة باستخدام أداة القطع الناقص رسم ROI في جميع أنحاء الغرفة الفلورسنت. هذا الحجم ROI يتوافق عادة إلى القطع الناقص 30 × 30 بيكسل للغرفة 10 ميكرون قطرها عرضها مع هدف 100X. تسليط الضوء على جميع رويس في إدارة العائد على الاستثمار. استخدام وظيفة "متعدد قياس" لتحديد متوسط ​​كثافة مضان من كل ROI خلال كامل الصورة المكدس. ملاحظة: البرنامج المساعد اسمه ستاckReg يمكن أن تستخدم لمحاذاة الصورة المكدس، إذا لزم الأمر. بعد الحصول على الخام آثار كثافة مضان لجميع الدوائر في التجربة، تحديد عنصر حتمية للتفاعل من خلال اتخاذ بمتوسط ​​بين التجريبي عبر كل آثار، وطرح المتوسط ​​من آثار الخام الفردية. استخدام البرمجيات تحليل البيانات مثل ايغور أو MS Excel لهذا التحليل. ملاحظة: هذا يوفر الضوضاء يتتبع لكل دائرة رد الفعل. تحليل الضوضاء التعبير الجيني من هذه الدوائر رد فعل باستخدام نفس الأساليب المستخدمة لتحليل الضوضاء التعبير الجيني المستمدة من الخلايا 25.

Representative Results

وميزة واضحة من هذا المنبر microfabricated هي في تطبيق السيطرة عليها من اللدائن المرنة "صمام التحكم" التي دفعتها بشكل مستقل من أجل حصر ردود الفعل CFPS (الشكل 2A). عندما دفعتها الجهاز، يتم الضغط غرف الغشاء ضد شريحة زجاجية لحصر الكواشف الفلورسنت في مجموعة واسعة من غرف رد فعل (الشكل 2C). من أجل التحقق من أن غرف حصر موثوق رد الفعل من خلال مدة التجربة، أجري FRAP الأساسي (الإسفار الانتعاش بعد photobleaching من) اختبار 37. تم تطبيق fluorophore (AF 555) إلى الجهاز، ودفعتها إلى صمام التحكم. باستخدام فتحة مصراع المجهر، بئر واحدة حصر fluorophore تم عزل وphotobleached بشكل فردي (الشكل 2D). على حسن اختيار أصبح الظلام ولم يتعافى في السطوع حتى ينخفض ​​ضغطها صمام التحكم 20 دقيقة60؛ وبعد، والإفراج عن غرفة من الزجاج. هذا الاختبار يتحقق من هذه الدوائر رد فعل لا تزال مختومة جيدا لمدة التجربة. في الظروف المثلى، وهو رد فعل CFPS إبداء البروتين تصور بسهولة (مثل GFP أو luciferase المراسل) يعبر عن البروتين يمكن كشفها في غضون بضع دقائق من يجري تطبيقها على هذا الجهاز. على مدى عمر من رد الفعل، وتصوير تخليق البروتين في الداخل والخارج من غرف رد فعل وكميا عن طريق قياس وحدات من كثافة مضان داخل كل غرفة (الشكل 3A). كثافة مضان الموافق تركيز البروتين، يمكن تعيينها على مر الزمن لكل دائرة رد الفعل (الشكل 3D). التعبير الجيني هو عملية العشوائية بطبيعتها أن يدخل تقلبات (الضجيج) في كل خطوة الجزيئية (التوليف، والتدهور، ملزم البروتين DNA، الخ) 20. فرع واحد من الضوضاء البيولوجيا يركز علىالقيمة الإثباتية من الجينات الدائرة الضوضاء 41. سوف التعبير في أنظمة خالية من الخلايا لديها آثار الضوضاء خارجي التي تنشأ عن التفاعل بين الآلات الجزيئية التعبير والأسطح التي تحدد حدود أوعية التفاعل. وهذه الآثار خارجي المرجح أن تصبح أكثر وضوحا كما تقتصر ردود الفعل خالية من الخلايا إلى غرف رد فعل حتى أصغر. القدرة على أداء الوقت الفاصل بين التصوير من عدة ردود فعل CFPS تقتصر ثم تمكن تحليل دقيق للهيكل الضوضاء (حجم وديناميكية) في نظم خالية من الخلايا يقتصر بطريقة مماثلة مباشرة إلى الأساليب التي تم الإبلاغ عن الأنظمة الخلوية 25. الشكل 3C وتبين 3D الدورات وقت التأسيسي التعبير GFP من المروج T7 في معيار صفيحة ميكروسكوبية 384 بشكل جيد مع حجم جيد من 15 ميكرولتر، مقارنة في PDMS غرف رد فعل 10 ميكرون في القطر، والمقابلة لحجم فقط حوالي 300 FL، حول سبعة أجلالصورة من حجم أقل. التباين في معدلات بروتين تعبير في 10 ميكرون غرف رد فعل هو أعلى بكثير مما كانت عليه في القياسات بشكل جيد لوحة، وتقترب من تلك التي ظهرت في الخلايا. ردود الفعل المضاعفة التي تجرى على جهاز يحمل حركية مماثلة لردود الفعل CFPS يقوم بكميات كبيرة على قارئ صفيحة ميكروسكوبية (الشكل 3B)، حيث هناك زيادة سريعة في مضان التي الهضاب، وغالبا ما يفترض أن يكون سبب محدودية الموارد داخل حجم رد الفعل 42،43 . هذا السلوك النمو القطعية، على الرغم من تذبذب، ويتسق عموما في جميع غرف رد الفعل، وبين التجارب – عن طريق حساب متوسط ​​آثار بين الغرف عبر التجارب، ويمكن طرح هذا الاتجاه القطعية من القيم أثر، ولم يتبق سوى مكونات الضوضاء من رد فعل (الشكل 4A) . ويبين الشكل 4B الضوضاء GFP التعبير بعد إزالة حتمية، المكون عابرة (أعلى)، والارتباط الذاتي من الضوضاء (القاع)، في حين يبين الشكل 4A آثار المقابلة في 10 ميكرون غرف رد فعل. توزيع في الأوقات نصف من آثار الارتباط الذاتي يعطي الاعتماد تردد من الضوضاء في حين أن الوقت تأخر الصفر من آثار الارتباط الذاتي يعطي مقادير من الضوضاء، والتباين. تقتصر الشكل 1. الكواشف توليف البروتين الخلية الحرة في فيمتولتر غرف رد فعل نطاق لغرض قياس الضوضاء التعبير الجيني. وتستخدم كواشف من نظام البروتين التعبير خالية من الخلايا التجاري إلى GFP صريح جوهري محصورة داخل PDMS غرف رد فعل. مجموعة من هذه الغرف يمكن تصور مع مرور الزمن مضان المجهر من أجل تميز التعبير البروتين والضوضاء التعبير الجيني. س كثافة مضانو كل غرفة التفاعل مع مرور الوقت قد تآمر على أنه أثر الفردي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. تلفيق اثنين من طبقة جهاز ميكروفلويديك مع غرف قابل للغلق على نطاق وفيمتولتر. (A) تخطيط وانفجرت ضوء طبقات الجهاز. ويتكون الجهاز من اثنين PDMS طبقات وساترة الزجاج. غشاء PDMS، مختومة بين الزجاج والسيطرة طبقات صمام، يحمل غرف رد فعل. (B) SEM صورة PDMS دائرة رد الفعل. قطر الداخلي هو 10 ميكرون. (C) تخطيطي للقنوات الإدخال في الجهاز. وجوا خلايا مجاني تخليق البروتين (CFPS) الكواشف من خلال قناة التفاعل. وضغط المياه في السيطرةصمام لضغط غرف رد فعل ضد شريحة زجاجية، وختم غرف 37. مستنسخة من المرجع. 37 بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء. (D) الإسفار الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP) اختبار على واحد جيدا باستخدام FITC يشير الغرفة غير مختومة جيدا ضد البيئة الخارجية. تم القبض على fluorophore في غرف (الصورة العليا) وphotobleached بئر واحد (الصورة السفلى). كان ينظر أي انتعاش مضان في غرفة photobleached حتى تم الافراج عن صمام التحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3. EGFP التعبير في المحصورة خلية مجاني رد الفعل. (A) وصور الإسفار من مختومة رد فعل ج hambers في نقاط زمنية المختار في رد الفعل. ويمكن رؤية إنتاج البروتين داخل غرف رد فعل وخارج غرف في القناة الرئيسية. تم استنساخ (B) EGFP في ناقلات Pet3a، وتوفير المروج T7 البلمرة وفاصل وموقع ملزمة الريبوسوم قوي (RBS). (C) القياسات مضان تطبيع التعبير التأسيسي من EGFP في رد فعل خالية من الخلايا بكميات كبيرة أجريت في قارئ صفيحة ميكروسكوبية. ردود الفعل CFPS عادة ما تنتج البروتين بسرعة قبل أن يتباطأ إلى مضان "حالة مستقرة" – وهذا يرتبط مع محدودية الموارد 43. شرطات سوداء تشير إلى متوسط ​​أثر. (D) مضان تطبيع من 51 الخام آثار كثافة مضان القراءة من 51 غرف رد فعل على مدى عدة تجارب. شرطات سوداء تشير إلى متوسط ​​أثر على العديد من التجارب، التي توضح المكون حتمية للتعبير البروتين./52616/52616fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4. آثار الضوضاء الفردية والضوضاء ترابط تلقائي من نظام الخلوي والخلية الحرة. (A) من أوستن وآخرون، 2006. الضوضاء في التعبير GFP (أعلى) وظائف الارتباط الذاتي تطبيع (القاع) تم الحصول عليها من تتبع إنتاج GFP في البكتيريا 25 الذين يعيشون. أعيد طبعها بإذن من ماكميلان للنشر المحدودة: [طبيعة] 25 (المجلد 439)، حقوق الطبع والنشر (2006). (B) الضوضاء في التعبير GFP (أعلى) وظائف الارتباط الذاتي تطبيع (القاع) تم الحصول عليها من إنتاج GFP في نظام خالية من الخلايا، تعقبها في ميكروفلويديك غرف رد فعل الجهاز. الرجاء انقر هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

التعبير الجيني في الخلايا صاخبة بطبيعتها نظرا لحجم الخلوية الصغيرة وأعداد نسخة منخفضة من الكواشف المهمة. الضوضاء البيولوجيا غالبا ما يركز على مصادر وتجهيز والعواقب البيولوجية من التقلبات في السكان، وتركيزات، المواقف، أو الدول من الجزيئات التي تتحكم الجينات الدوائر والشبكات 44. وقد تم تنفيذ الغالبية العظمى من هذا العمل في الأنظمة الخلوية، التي لديها ميزة عرض ضجيج دائرة الجينات ضمن السياق الطبيعي للشبكات الجينية داخل الخلية. ومع ذلك، نظم خالية من الخلايا تسمح توصيف التقلبات الجوهرية للدائرة الجينات الفردية من دون آثار خارجي التباس 18 التي لا يمكن تجنبها في الأنظمة الخلوية. تحليل الضوضاء يمكن أن تقدم رؤى المادية مهمة في كيفية الوراثية الدوائر ومنظم وكيفية عملها، واستخدمت في الأنظمة الخلوية لتوصيف سلبي 25 وايجابية <suP> 27 تنظيم ذاتي، خارجي والمساهمات الجوهرية للضوضاء التعبير 18، والنسخي انفجار 45،46. نحن هنا وصف دراسة نظام التعبير خالية من الخلايا في أجهزة ميكروفلويديك التي تمكن من السيطرة في وقت واحد من حجم المفاعل وبدء رد فعل مرات، من أجل فهم أفضل الأدوار التي الحبس والازدحام 47،48 يكون على الجوهري الضوضاء البروتين التعبير دون المضاعفات المرتبطة مع الخلايا الحية.

مفتاح سمة من سمات التصميم تمكن هو دمج صفائف فيمتولتر الحجم (ميكرون النطاق) غرف رد فعل تستخدم لحصر المواد المتفاعلة نظام البروتين التعبير خالية من الخلايا، مع اللدائن المرنة "صمام التحكم" غشاء في PDMS التي يعوض لل الكواشف في "الوقت الصفر" واضحة المعالم لبدء التفاعل (الشكل 1). هذه السيطرة تسمح حركية التفاعلات المشاركة في تخليق البروتين إلى أن الفلالمستحقة في الوقت الحقيقي مع دقة عالية. على هذا النحو، فمن المهم لإدارة الكواشف خالية من الخلايا بحيث يتم التقليل من التباين بين تجريبي قدر الإمكان. هذا التحكم يسمح لنا لتقييم هيكل الضوضاء الدوائر الوراثية خالية من الخلايا بطريقة غير مشابهة لتقنيات المستخدمة سابقا لتقييم التعبير الجيني في الخلايا الحية.

كما الكواشف المستخدمة في أنظمة CFPS يمكن أن تكون حساسة لتجميد أذاب دورات، فمن المهم للحفاظ على الكواشف البرد وتقليل الوقت الذي تقضيه في الذوبان الكواشف على الجليد. ومن الممارسات الجيدة لاختبار دوري للتعبير عن نظام CFPS بكميات كبيرة من أجل تحديد التغيرات في مستويات التعبير مع مرور الوقت – وهذا يمكن ان يتم ذلك في رد فعل 10-15 ميكرولتر في أنبوب إيبندورف، أو في جهاز مثل قارئ صفيحة ميكروسكوبية ، الذي يؤدي متعددة يقرأ مع مرور الوقت لالتقاط حركية التفاعل. ومشيرا إلى العمر وذوبان الجليد في أوقات المواد المتفاعلة لكل تجربة مساعدة عند استكشاف منخفض التعبير لevels. وعلاوة على ذلك، عند تجميع الكواشف CFPS، فمن المهم أن نلاحظ أن يبدأ رد الفعل مرة واحدة يتم تجميعها بشكل كامل وإزالتها من الجليد. من أجل الحفاظ على "الوقت الصفر" ثابت، فإنه من المفيد لتسجيل وقت بعد الشروع في رد فعل CFPS بعد إضافة النهائية للمدخلات DNA، وتطبيق رد فعل في أسرع وقت ممكن إلى الجهاز المحتضنة. هذه العملية يجب أن يأخذ حوالي 4-5 دقائق، ويجب أن لا تكون بعد مضان مرئية داخل غرف رد فعل. تؤكد هذه السيطرة أن الوقت المتاح لتصور جزء نمو منحنى رد فعل تكبير.

قبل تشغيل ردود الفعل CFPS على الجهاز، فإنه من المستحسن لتشغيل اختبارات مراقبة الجودة للتحقق من عدم وجود تسرب من غرف. اختبار FRAP يمكن أن يؤديها (كما في الشكل 2D) عن طريق تطبيق fluorophore إلى الجهاز وفضح بئر الفردية حتى البئر ابيض تماما. إذا كانت الدوائر هيمختومة جيدا، يجب أن يكون هناك انتعاش مرئية داخل البئر – يجب أن يكون هناك تناقض صارخ بين جدران حجرة والمساحات الداخلية والخارجية. إذا انتعاش مضان واضح أو لا يتم تعريف جدران غرفة رد فعل جيدا، ينبغي زيادة الضغط على صمام التحكم أو يجب فحص الجهاز لتسرب أو التبطين من شريحة زجاجية.

وقد تم اختبار هذا البروتوكول مع الكواشف CFPS من E. التجاري القولونية خالية من الخلايا عدة البروتين التعبير (تدرج إلى 25 ميكرولتر)، على الرغم من أنظمة CFPS قوية أخرى يمكن أن تستخدم. ومن الممكن استخدام كميات أقل بكثير من 25 ميكرولتر عند تطبيق ردود الفعل على الجهاز، والتي قد تكون مفيدة عندما تكلفة كاشف هو العامل المحدد في التجارب. مرة واحدة يتم إضافة الكواشف إلى الجهاز وأغلقت الدوائر رد فعل، فإنه ليس من الممكن إضافة الكواشف إلى حل من دون صمام التحكم-المشغلات دي – وبالتالي هذا الجهاز غير suitabلو لردود الفعل التي تتطلب إضافة الكواشف أثناء التفاعل. كما لا أمثل هذا الجهاز لرصد ردود الفعل CFPS التي قد تعمل لفترة أطول من 3 ساعات – آثار الجفاف وتجفيف الجهاز بعد هذه الفترة الزمنية لم يتم تقييمها. وإذا رغبت رد فعل مرات أطول، ويمكن التخفيف من هذه الآثار بإغلاق الجهاز لمنع التبخر، وتغيير درجة حرارة الحضانة، أو باستخدام غرفة الرطوبة. تعديلات على تصميم الجهاز، مثل الهياكل nanoporous في جدران غرفة 49،50 أو إدراج طبقة الغشاء مسامية، تمثل عدد قليل من الطرق التي يمكن أن تتيح تبادل كاشف وبالتالي إطالة فترات زمنية رد فعل.

مقصورات رد فعل Microfabricated من حجم موحد ذات قيمة للحفاظ على أبعاد متناسقة عبر التجارب ومناسبة للغاية للتحقيق في "التفاعلات الجانبية" مع جدران المقصورة. وخلافا للطرق باستخدام أيتقنيات ن microfabricated، يجب أن يتم تقييم هذه التفاعلات في أعداد صغيرة، وليس لتوفير المرونة الأبعاد خلال التجارب. ومع ذلك، فإن تصميم السيطرة عليها لهذه الدوائر رد فعل مناسب للغاية لمرور الزمن المجهري، ويمكن أن يكون مكملا لإلقاء الضوء على طريقة الإنتاجية العالية من الحبس.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
SU-8 2015 Microchem SU-8 2000 series Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Thinner Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Developer Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Chlorotrimethylsilane Sigma Aldrich 92360 FLUKA Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.
Sylgard 184 PDMS Dow Corning SYLGARD 184
0.75 mm hole-puncher Ted Pella Inc. 15072 Harris Uni-Core
23 ga needles blunt tip Component Supply Co. /NE-231PL-25
#0 glass coverslip Ted Pella Inc. 260366 Gold Seal
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Microscope Nikon Instruments Eclipse TE 300
CCD camera Roper Scientific CoolSNAP-HQ
Shutter Shutter Insturment Lambda SC
Light Source Nikon Intensilight C-HGFI
Color Filters Chroma Technology Corp. ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission
100x oil-immersion objective Nikon N.A. 1.4
Temperature Regulator Oko Lab H201-T
Metamorph Universal Imaging Corp. Version 7.8.3.0
Marsh Bellofram transducers Marsh Bellofram T2000
24 gauge PTFE tubing Component Supply Co. /SWTT-24-C
Septum vials National Scientific C4015- 17W
Power Supply Hewlett Packard 6205B Dual DC Power Supply
sharp 23 ga needles Precision Glide 305129
Male-to-male luer lock adapters Qosina 20024 Polycarbonate
Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga. Component Supply Co. /NE-232PL-5C Polypropylene
S30 E coli protein expression system Promega L1110
Pet3a-GFP vector/protein Novagen 69418-3 Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.
Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit Biorad #732-6120
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Alexafluor 555 Molecular Probes AF555 http://www.lifetechnologies.com
ImageJ National Institutes of Health Version 1.46r
Plugin: Time Series Analyzer Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA Version 3.0
Plugin: StackReg/TurboReg Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group Distribution is dated July 7, 2011
Plugin: ROI Manager Tools Tiago Ferreira 12/15/2013 Version
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Klammt, C., et al. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins. European Journal of Biochemistry. 271, 568-580 (2004).
  2. Wong, R. W., Blobel, G. Cohesin subunit SMC1 associates with mitotic microtubules at the spindle pole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 15441-15445 (2008).
  3. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 15985-15990 (2013).
  4. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS synthetic biology. 1, 408-413 (2012).
  5. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  6. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 14, 7322-7330 (1994).
  7. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of visualized experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  8. Karig, D. K., Jung, S. -. Y., Srijanto, B., Collier, C. P., Simpson, M. L. Probing cell-free gene expression noise in femtoliter volumes. ACS synthetic biology. 2, 497-505 (2013).
  9. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS synthetic biology. 1, 29-41 (2012).
  10. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
  11. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production – a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and bioengineering. 108, 1570-1578 (2011).
  12. Kato, A., Yanagisawa, M., Sato, Y. T., Fujiwara, K., Yoshikawa, K. Cell-Sized confinement in microspheres accelerates the reaction of gene expression. Scientific reports. 2, 283 (2012).
  13. Simpson, M. L., Sayler, G. S., Fleming, J. T., Applegate, B. Whole-cell biocomputing. Trends in biotechnology. 19, 317-323 (2001).
  14. Korobkova, E., Emonet, T., Vilar, J. M., Shimizu, T. S., Cluzel, P. From molecular noise to behavioural variability in a single bacterium. Nature. 428, 574-578 (2004).
  15. Weinberger, L. S., Burnett, J. C., Toettcher, J. E., Arkin, A. P., Schaffer, D. V. Stochastic gene expression in a lentiviral positive-feedback loop: HIV-1 Tat fluctuations drive phenotypic diversity. Cell. 122, 169-182 (2005).
  16. Arkin, A., Ross, J., McAdams, H. H. Stochastic kinetic analysis of developmental pathway bifurcation in phage λ-infected Escherichia coli cells. Genética. 149, 1633-1648 (1998).
  17. Kulkarni, R. P., Dworkin, J., Garcia-Ojalvo, J., Elowitz, M. B. Tunability and noise dependence in differentiation dynamics. Science. 315, 1716-1719 (2007).
  18. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  19. McAdams, H. H., Arkin, A. Stochastic mechanisms in gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 814-819 (1997).
  20. Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6, 451-464 (2005).
  21. Blake, W. J., Kærn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. Noise in eukaryotic gene expression. Nature. 422, 633-637 (2003).
  22. Rao, C. V., Wolf, D. M., Arkin, A. P. Control, exploitation and tolerance of intracellular noise. Nature. 420, 231-237 (2002).
  23. Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135, 216-226 (2008).
  24. Pedraza, J. M., van Oudenaarden, A. Noise propagation in gene networks. Science. 307, 1965-1969 (2005).
  25. Austin, D., et al. Gene network shaping of inherent noise spectra. Nature. 439, 608-611 (2006).
  26. Simpson, M. L., Cox, C. D., Sayler, G. S. Frequency domain analysis of noise in autoregulated gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 4551-4556 (2003).
  27. Weinberger, L. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Transient-mediated fate determination in a transcriptional circuit of HIV. Nature genetics. 40, 466-470 (2008).
  28. Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 383-392 (2009).
  29. Nourian, Z., Danelon, C. Linking genotype and phenotype in protein synthesizing liposomes with external supply of resources. ACS synthetic biology. 2, 186-193 (2013).
  30. Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. The minimal size of liposome-based model cells brings about a remarkably enhanced entrapment and protein synthesis. ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).
  31. Nomura, S. i. M., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. ChemBioChem. 4, 1172-1175 (2003).
  32. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).
  33. Park, N., Um, S. H., Funabashi, H., Xu, J., Luo, D. A cell-free protein-producing gel. Nature. 8, 432-437 (2009).
  34. Swaay, D., deMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13, 752-767 (2013).
  35. Okano, T., Matsuura, T., Kazuta, Y., Suzuki, H., Yomo, T. Cell-free protein synthesis from a single copy of DNA in a glass microchamber. Lab on a Chip. 12, 2704-2711 (2012).
  36. Ito, T., Okazaki, S. Pushing the limits of lithography. Nature. 406, 1027-1031 (2000).
  37. Fowlkes, J. D., Collier, C. P. Single-molecule mobility in confined and crowded femtolitre chambers. Lab on a Chip. 13, 877-885 (2013).
  38. Herold, K. E., Rasooly, A. . Lab on a Chip Technology: Biomolecular separation and analysis. 2, (2009).
  39. Unger, M. A., Chou, H. -. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  40. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic acids research. 40, 3763-3774 (2012).
  41. Cox, C. D., McCollum, J. M., Allen, M. S., Dar, R. D., Simpson, M. L. Using noise to probe and characterize gene circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 10809-10814 (2008).
  42. Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. . American Control Conference (ACC), 2013. , 1531-1536 (2013).
  43. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm). Biotechnology and bioengineering. 87, 465-471 (2004).
  44. Simpson, M. L., et al. Noise in biological circuits. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 1, 214-225 (2009).
  45. Dar, R. D., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 17454-17459 (2012).
  46. So, L. -. h., et al. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nature genetics. 43, 554-560 (2011).
  47. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., LeDuc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nat Nano. 8, 602-608 (2013).
  48. Sokolova, E., et al. Enhanced transcription rates in membrane-free protocells formed by coacervation of cell lysate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 11692-11697 (2013).
  49. Retterer, S. T., Siuti, P., Choi, C. -. K., Thomas, D. K., Doktycz, M. J. Development and fabrication of nanoporous silicon-based bioreactors within a microfluidic chip. Lab on a Chip. 10, 1174-1181 (2010).
  50. Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab Chip. 11, 3523-3529 (2011).

Tags

Cell-free BiologyFemtoliter ChambersPDMS DeviceCell-free Protein SynthesisReaction KineticsGene CircuitsNoise Biology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Norred, S. E., Caveney, P. M., Retterer, S. T., Boreyko, J. B., Fowlkes, J. D., Collier, C. P., Simpson, M. L. Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology. J. Vis. Exp. (97), e52616, doi:10.3791/52616 (2015).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image