Системная бактериальная инфекция и иммунная Фенотипы обороны в<em> Дрозофилы</em

1. Сбор и подготовка Мухи Задняя Д. MELANOGASTER под желаемых условий эксперимента. Позаботьтесь, чтобы не переполнять мух в период выращивания и убедитесь, что личинки плотности согласуются по лечения, так как условия окружающей среды во время личиночной стадии может глубоко затронуть иммунной защиты фенотипы во взрослой стадии. 15 Сбор экспериментальных мух 0 – 3 дней после вылупления из куколки случае и передать их на свежую среду. Дом собранные мухи на желаемой температуры (температура между 22 ° C и 28 ° C, как правило, подходят), пока они не будут в возрасте 5 – 7 дней после вылупления. ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет достаточно времени для мух, чтобы завершить метаморфоз и стать зрелым взрослым, но задолго до того, начинается старение. Сортировать нужное количество мух в отдельном флаконе до заражения, снова стараясь избежать переполненности. ПРИМЕЧАНИЕ: Только мале инфицированы в этой демонстрации, но в равной степени можно заразить самок, используя процедуру, описанную. 2. Культура и подготовка бактерии Подготовка мастер-пластины выбранных бактерий, по крайней мере за 2 дня до инфекции. Подряд бактерии из 15% глицерина складе хранить неопределенно долго при -80 ° С. Храните мастер пластину на 4 ° C в течение 2 недель. Всегда полоса мастер пластины непосредственно из замороженного глицерина складе. Избегайте серийный прохождение бактерий от пластины к пластине, а повторное прохождение в культуре может привести к бактериям развиваться ослабленный вирулентность. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот пример использует Провиденсия rettgeri и кишечной палочки. Используйте следующую процедуру, чтобы подготовить бактериальной суспензии для инъекций. Выращивают культуру в 2 мл бактерий путем инокуляции стерильной среды с одной колонии, выделенной из основной пластины. Вырастить бактерии в стационарной фазе (например, </em> O / N рост при 37 ° С). ПРИМЕЧАНИЕ: Оба П. rettgeri и E.coli, хорошо растут в бульоне Luria при температуре от 20 – 37 ° С при осторожном встряхивании. Как только культура достигла стационарной фазы, осторожно гранул клетки от прибл. 600 мкл культуры в настольной центрифуге (3 мин при 5000 мкг), отбросить супернатант, и ресуспендируют бактерий в ок. 1000 мкл стерильной фосфатным буферным раствором (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 PO 4, 1,8 мМ KH 2 PO 4, рН 7,4). Развести ресуспендировали клеток в стерильной PBS для достижения оптической плотности (OD), подходящий для бактерии используются, измеренной на спектрофотометре как поглощение при 600 нм. Используйте этот подвеску, чтобы заразить мух. ПРИМЕЧАНИЕ: 600 = 0,1 или 1,0 соответствует соответственно примерно 10 и 8 10 9 Провиденсия rettgeri или E. палочка на мл. Потому что оба живутй мертвые бактерии способствуют оптической плотности, важно, чтобы собрать культур в начале стационарной фазы, прежде чем бактериальные трупы накапливаются и искажают отношения между оптической плотностью и количеством жизнеспособных бактерий, введенных во время инфекции. 3. заразить Мухи Примечание: В дрозофилы иммунитета зависит от суточного ритма, очень важно, чтобы выполнить инфекции в подобной времени суток через экспериментальных повторов 16. 3.1) Использование Nanoinjector Подготовьте стеклянные иглы для инфекции. Подготовка стекла иглы, потянув боросиликатного стекла капилляр с помощью микропипетки съемник. Использование щипцов, разорвать кончик иглы, чтобы создать отверстие приблизительно 50 мкм диаметром, чтобы выброс жидкости. Соберите форсунку. Поместите уплотнительное кольцо круглого сечения, а затем белый SpAcer (большой вмятина наружу) на металлической поршень. Заполните стеклянную иглу с минеральным маслом с помощью шприца с иглой 30 G. Поместите заполненную стеклянной иглу через цангу, а затем поместить большее уплотнительное кольцо вокруг его основания, около 1 мм от тупого конца иглы. Слайд иглу на металлическую поршня и не аккуратно заверните цанги до упора. Извлечение большую часть минерального масла из инжектора, но убедитесь, что все еще существует небольшой объем масла в иглу, чтобы действовать в качестве барьера между инжектором и бактериальной суспензии. Убедитесь, что нет воздушных пузырьков внутри минерального масла или бактериальной суспензии, или между двумя жидкостями. Установите форсунку до желаемого объема для инъекций (между 9 и 50 NL NL). Создание ранив управления. Заполните иглу инжектора стерильным PBS аккуратно вставив кончик капиллярной иглы в трубке СМИ и Pressiнг кнопку "Заполнить" на форсунки. Примечание: стерильными средами рост бактерий также могут быть использованы в ранив контроль, если эксперимент требует инъекцию бактерий, взвешенных в их среде для выращивания. Однако, поскольку бактериальные питательные среды содержат компоненты, которые могут стимулировать иммунную систему или другие эффекты на хосте, инертный носитель, такой как PBS, является предпочтительным. Анестезировать нужное количество мух под световым потоком CO 2. Вводите мух в передней части живота на вентролатеральной поверхности стерильной PBS. Примечание: Можно также вводить летит на других сайтах, таких как sternopleural пластины грудной клетки, но важно, чтобы сохранить место инъекции последовательное течение каждого эксперимента 17. Поместите инъекционные мух в свежих флаконах с новой средой, укладка флаконов на их стороне, пока все мухи оправились от анестезии, чтобы предотвратить мух от застревали в пищу. <ш /> Примечание: Рекомендуется вводить управляющие PBS мух перед инъекцией бактерии экспериментальных мух так же иглы могут быть использованы как для лечения. Это не всегда можно будет использовать тот же иглу в течение всего эксперимента. В этом случае, может быть желательно, чтобы записать котором игла была использована, с которой летит и включить идентичность иглы в качестве экспериментальной фактор статистического анализа. Вводите бактериальной патогена. Извлечение оставшейся стерильный носитель от инжектора и пополнить ту же иглу с бактериальной суспензией. Повторите описанную выше процедуру (3.1.3), в настоящее время инъекционных мух бактериальной суспензии, полученной в процедуре 2.2. 3.2) с септическим укол Подготовьте иглу для прокалывания. Растопить конец микропипетки наконечник 200 мкл и вставьте 0,15 мм насекомых minutien штифт в расплавленной пластмассы. Разрешить пластик, чтобы укрепить суч, что штифт удерживается на месте с приблизительно 0,5 см штифта, выступающих из пластика. Создание ранив управления. Анестезировать нужное количество мух под световым потоком CO 2. Укол мух в sternopleural пластины грудной клетки с иглой, избегая вложений сайты крыльев и ног. При необходимости, осторожно удалить мух от minutien контактный использованием мягких щипцы. Примечание:. Можно также, чтобы проколоть летит на других сайтах, таких как передней брюшной полости на поверхности вентролатеральной, но важно, чтобы сохранить место инъекции последовательное течение каждого эксперимента 17 Укалывание через кутикулу живота имеет тенденцию быть более труднее, чем прокалывание грудной клетки и, следовательно, реже. Поместите кололи мух в свежем флакон с новой летучей среды, укладка флакон на его стороне, пока все мухи были извлечены из анестезии, чтобы предотвратить мух от ВЕпридя застрял в пищу. Представьте бактериальной инфекции. Анестезировать нужное количество мух под световым потоком CO 2. Укол друг летать в том же месте, управления СМИ, опуская кончик пальца в бактериальной суспензии, полученной в порядке, прежде чем колоть 2.2 каждый муху. Поместите кололи мух в свежем флакон с новым лету среды, закладывая флакон на его стороне, пока все мухи не оправились от анестезии, чтобы предотвратить мух от застревали в пищу. 3.3) Оценка инфекционная доза Поставляется Инфекция набор мух, как описано выше, в любом порядке, 3.1 или 3.2, только вместо возвращения мух в пищевой флакон, чтобы оправиться от наркоза, поместите каждый летать в микроцентрифужных трубки на льду. Добавить 250 мкл PBS в каждую пробирку и гомогенизируют мух либо с помощью пестика или шарик било. </ LI> Плита гомогената на агар пластины LB, либо с помощью спиральной Plater или серийное разведение. К пластине с помощью последовательного разбавления, передавать каждый мухи гомогената к первому ряду 96-луночного планшета. Заполните каждую лунку остальных строк с 90 мкл PBS. Используя многоканальную пипетку, возьмите 10 мкл из первого ряда, содержащего летать гомогената и обойтись во второй ряд. Внесите вверх и вниз, по крайней мере 10 раз, чтобы тщательно перемешать, а затем принять 10 мкл и перенести к третьему ряду. Повторите эту процедуру, используя оставшиеся строки. Начиная с нижнего ряда (наиболее разбавить бактерий подвески), использовать многоканальную пипетку принять 10 мкл из каждой лунки и депозит на LB пластины, заботясь о том, что образцы отпускаются в виде дискретных точек, которые не касаются друг друга. Повторите, пока все лунки не были отобраны образцы из каждой строки, выдачи их в порядке убывания разбавления на LB пластины. </li> Оставьте пластину при комнатной температуре до тех пор, пятна не полностью всасывается в LB пластины. Примечание: Сушка LB пластины в течение нескольких дней при комнатной температуре перед использованием рекомендуется, чтобы гарантировать, что жидкость быстро всасывается, минимизировать вероятность случайного контакта между образцом пятен. Инкубируйте пластины O / N, заботясь, чтобы не зарастают пластины так колонии остаются маленькими и дискретные. Примечание: В зависимости от средой роста бактерий и используемой температуры инкубации, колонии, полученные из эндогенных микрофлоры кишечника мухи в конечном итоге может появиться на пластине. Тем не менее, большинство бактерий, используемых для патогенных инфекций растут гораздо быстрее, чем микрофлоры кишечника на LB агаре при 37 ° С. Удалить пластины из инкубатора, когда экспериментальные бактерии выросли видимые колонии (обычно 8 – 12 ч), но прежде, чем Drosophila микрофлоры кишечника колонии появляются (примерно 36 ч). Для медленно растущих экспериментальных бактерий, использовать селективныйантибиотик в агар LB, чтобы удалить любые колоний от микрофлоры кишечника. Подсчитайте количество колоний для каждого гомогената. Для спиральных пластин, подсчет колоний, которые растут с использованием автоматического счетчика колоний, которые можно оценить бактериальной нагрузки на мл гомогената на основе количества и положения колоний на пластине. Примечание: Спиральные рассчитывает наиболее точным при бактериальной концентрации в диапазоне от 5 × 10 2 до 5 · 10 4 бактерий на мл. Для спот пластин вручную рассчитывать колонии для каждой из любого лету разведение содержит 30 – 300 колоний и подсчитать количество бактерий на миллилитр гомогената оригинальной. 4. Охарактеризуйте выживаемость инфекции Анализ смертности после инъекции. Поместите инфицированных мух и раненых управления в свежих флаконах и поддерживать в инкубаторе при требуемой температуре (25 ° C с 12:12 осветиHT: темно цикл рекомендуется). Не ставьте больше, чем 15 мух в одном флаконе, как она становится трудно рассчитывать более чем на 15 жизни мух. Подсчитайте количество живых и мертвых мух каждый день или чаще, если это необходимо. В целях поддержания качества продуктов питания, флип мух в новой пищи на регулярной основе. Если флакон содержит только мужчин, передавать их на свежие флаконах каждые три дня. Если флакон содержит самок, передать свежих флаконах каждые два дня, потому что личиночной потомство разжижения пищи, увеличивая риск того, что взрослые мухи может застрять и в результате завышенных показателей смертности из-за инфекции. Статистического анализа данных. Выживание земля в виде кривой Каплана-Майера, которая указывает вероятность того, что человек будет выжить измеренному после инъекции времени точки. 18 Для кривых выживания, которые не пересекают, выполнять парные сравнения с использованием лог-рангового TEST (также называется каминные Кокс тест) или выполнять более сложные анализы, используя модели пропорциональных рисков Кокса, который может включать несколько факторов и их взаимодействий. Для кривых выживания, которые пересекают, выполнять анализ Кокса расслаивается. 17 5. Анализ бактериальной нагрузки Post-инфекции Измерьте бактериальной нагрузки. В заданного времени после инъекции, повторить процедуру, используемую для оценки инфицирующей дозы для определения бактериальной нагрузки по ходу инфекции (см протокол 3.3). Примечание: При использовании спиральной Plater, разбавленные гомогенатов, так что бактериальную суспензию находится в пределах от 1000 – 100000 на мл бактериальной. Анализ данных. Если бактериальная нагрузка не является нормальным, либо преобразовать данные, чтобы лучше приблизить нормальное распределение или анализировать данные, используя непараметрический статистический анализ (например, тест Манна-Уитни). Используйте анализ Бокса-Кокса для Fинд оптимальное преобразование; натуральный логарифм или базу -10 преобразования журнала часто эффективны. 19 Если данные достаточно нормально распределены, и есть только два процедуры их контрастные, выполнить т Испытайте для определения привести два метода лечения в различных средних бактериальных нагрузок. Если есть несколько экспериментальных переменных или других потенциально прогностические факторы, использовать дисперсионный анализ (ANOVA) для определения, какие факторы являются значимыми предикторами бактериальной нагрузки. 19 6. Анализ активации транскрипции генов иммунной системы Чтобы визуализировать грубо иммунную активацию после заражения, заражают трансгенных мух, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем промотора из противомикробного пептида гена, как описано выше. 18 Просмотр зараженных мух под флуоресцентным микроскопом с поддержкой; Индукция GFP должно стать visibле в жировом теле в течение первых 6 – 10 часов после заражения. Для более точного количественного определения иммунной активации, используйте количественный ПЦР на кДНК шаблон (Qrt-PCR) для измерения обилие противомикробных гена пептид-транскриптов. ПРИМЕЧАНИЕ: выражение иммунных генов может быть измерена в любое время после (или до) инфекции. Вообще говоря, индукция экспрессии генов иммунной начинается примерно 4 часа после инъекции и увеличивается в течение следующего 24 часа. Обезболить мух, используя CO 2. Поместите 15 мух в пробирке для каждой экстракции РНК. ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы собрать по меньшей мере, три одинаковых образцов для каждого условия лечения. Экстракт РНК от мух и генерировать первой нити кДНК с использованием любой из ряда стандартных процедур или коммерческих наборов. Магазин РНК при -80 ° С. Магазин кДНК при -20 ° С в течение периодов в несколько недель, а при -80 ° С в течение длительного хранения. До экстракции РНК, магазин ележит при -80 ° С. Выполнение количественной ПЦР (КПЦР) на генов-мишеней, представляющих интерес с использованием кДНК в качестве матрицы. В Таблице 1 для последовательностей праймеров для амплификации генов антибактериальных пептидов Diptericin A, Drosomycin, дефенсина, Attacin A и Metchnikowin, а также ген rp49 управления уборка (также известный как rpL32). ПРИМЕЧАНИЕ: Гены, кодирующие антимикробные пептиды Diptericin А и Drosomycin обеспечивают очень хорошие показания Д. MELANOGASTER иммунной активности, вызванной, главным образом, через IMD и Toll путей, соответственно. Для того, чтобы контролировать для образца к образцу изменчивости доходности РНК и эффективности обратной транскрипции, стандартизировать записанный экспрессию генов-мишеней против гена ссылка домашнего хозяйства, экспрессия которого не должна измениться с инфекцией, таких как rp49 (также известных как RPL 32). Анализ данных. <ол> Для грубом приближении различий экспрессии, вычислить отношение (SQ) значения начальной величины, полученной из гена испытаний (например, Diptericin) по отношению к значению SQ полученной от контрольного гена (например, rp49) для каждого образца (в пересчете на SQ – DPTA / SQ – rp49). Масштаб этих коэффициентов к базовой терапии управления, например, неинфицированных контроля обработки. Произвольно установить контроль уровня экспрессии, равный 1,0, и визуализировать экспериментальные процедуры, как изменения относительных сгиба. Оценить значение SQ для каждого гена против стандартной кривой, полученной из серии разведений известных-количество кДНК. ПРИМЕЧАНИЕ: Статистический анализ соотношений может быть сложным, поэтому такой подход лучше для быстрого приближения, чем для тщательного анализа. Если эффективность ПЦР низкий, разрабатывать новые праймеры для улучшения кинетики ПЦР, если это возможно. Для КПЦР реакции с почти идеальной эффективности (объявлениеoubling продукта ПЦР в каждом цикле), пороговый цикл (С Т) может быть заменен на значение SQ. Для простых экспериментов с оптимально эффективного усиления, данные могут быть проанализированы с помощью метода ΔΔC T. 19 Для каждого образца, вычтите значение С Т контрольного гена (например, rp49) от C T гена испытаний (например,., Diptericin ) с получением & delta; C T. Затем вычесть delta; C T от исходного контроля со стороны delta; C T для каждого экспериментального образца, получая значение ΔΔC T для каждого образца; это ΔΔC Т свидетельствует относительных различий в уровнях экспрессии генов между курсами лечения, где 2 (-ΔΔCT) аппроксимирует раза изменение экспрессии. Примечание: Этот анализ может плохо неверная оценка раскладочное изменение экспрессии гена-мишени, если ПЦР либо гена испытаний или ссылкиген имеет низкую эффективность. Для наиболее тщательного анализа, проводить анализ отклонений (ANOVA) с использованием оцененного экспрессию гена испытаний (например, Diptericin A) в качестве переменной отклика и расчетное выражение гена управления (например, rp49) и других экспериментальных факторов в качестве независимых переменных. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подход является относительно устойчивым к неэффективности в ПЦР-амплификации и позволяет анализ более сложных экспериментальных конструкций.