Infection bactérienne systémique et défense immunitaire phénotypes<em> Drosophila melanogaster</em

1. Recueillir et préparer mouches D. arrière melanogaster dans les conditions expérimentales souhaitées. Prenez soin de ne pas surcharger les mouches pendant l'élevage et assurez-vous que les densités larvaires sont compatibles pour tous les traitements, car les conditions environnementales durant le stade larvaire peuvent affecter profondément phénotypes de défense immunitaire lors de l'étape adulte. 15 Recueillir mouches expérimentales 0 – 3 jours après l'éclosion de la coque de nymphose et de les transférer sur un milieu frais. Maison vol recueillies à une température souhaitée (températures comprises entre 22 ° C et 28 ° C conviennent généralement) jusqu'à ce qu'ils soient âgés de 5 – 7 jours après l'éclosion. NOTE: Ce laisse suffisamment de temps pour les mouches pour compléter la métamorphose et devenir des adultes matures, mais est bien avant le début de la sénescence. Triez le nombre souhaité de mouches dans un flacon séparé avant l'infection, en prenant également soin d'éviter la surpopulation. NOTE: Seulement males sont infectés dans cette démonstration, mais est également possible d'infecter les femmes utilisant la procédure décrite. 2. Culture et préparer des bactéries Préparer une plaque de maître des bactéries choisies au moins 2 jours avant l'infection. Streak les bactéries à partir d'un stock de glycérol 15% stockées indéfiniment à -80 ° C. Conservez la plaque de maître à 4 ° C pendant 2 semaines. Toujours série plaques maîtresses directement à partir du stock de glycérol congelés. Évitez passage en série de bactéries de plaque en plaque, comme le passage répété dans la culture peut causer des bactéries d'évoluer virulence atténuée. NOTE: Cet exemple fait usage de Providencia rettgeri et Escherichia coli. Utilisez la procédure suivante pour préparer une suspension bactérienne pour l'injection. Cultiver une culture de 2 ml de bactéries par inoculation d'un milieu stérile avec une seule colonie isolée à partir de la plaque maîtresse. Cultiver les bactéries à la phase stationnaire (par exemple, </em> O / N croissance à 37 ° C). REMARQUE: Les deux P. rettgeri et E. coli poussent bien dans du bouillon de Luria à des températures de 20 à 37 ° C en agitant doucement. Une fois que la culture a atteint la phase stationnaire, culot en douceur les cellules à partir d'env. 600 pl de la culture dans une centrifugeuse de table (3 min à 5000 xg), jeter le surnageant et remettre en suspension les bactéries dans env. 1000 pl de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS; NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 PO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4 à pH = 7,4). Diluer les cellules remises en suspension dans du PBS stérile pour obtenir une densité optique (DO) correspondant pour la bactérie utilisée, mesurée avec un spectrophotomètre en tant que l'absorbance à 600 nm. Utiliser cette suspension pour infecter les mouches. NOTE: A 600 = 0,1 ou 1,0 correspond respectivement à environ 10 8 et 10 9 Providencia rettgeri ou E. coli par ml. Parce que les deux vivent unee bactéries mortes contribuent à la densité optique, il est important de récolter des cultures au début de la phase stationnaire avant cadavres bactériens accumuler et déformer la relation entre la densité optique et le nombre de bactéries viables introduites au cours de l'infection. 3. Infect les mouches NOTE: Comme l'immunité chez la drosophile est influencée par le rythme circadien, il est important d'effectuer les infections à la même époque de la journée à travers les répétitions expérimentales 16. 3.1) Utilisation d'un Nanoinjector Préparer les aiguilles de verre pour l'infection. Préparer une aiguille de verre en tirant un capillaire en verre de borosilicate à l'aide d'un extracteur de micropipette. En utilisant des pinces, brisez la pointe de l'aiguille pour créer une ouverture d'environ 50 um de diamètre pour permettre l'éjection de liquide. Monter l'injecteur. Placez le joint torique puis l'sp blancacer (grande fossette vers l'extérieur) sur le piston de métal. Remplir l'aiguille de verre avec de l'huile minérale en utilisant une seringue avec une aiguille 30 G. Mettez l'aiguille de verre rempli par la pince, puis placez le joint torique plus grande autour de sa base, d'environ 1 mm de l'extrémité émoussée de l'aiguille. Faites glisser l'aiguille sur le piston métallique et vissez doucement sur le collet jusqu'à sécurisé. Ejecter la plupart de l'huile minérale de l'injecteur, mais assurez-vous qu'il ya encore un petit volume d'huile dans l'aiguille à agir comme une barrière entre l'injecteur et la suspension bactérienne. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans l'huile minérale ou de la suspension bactérienne, ou entre les deux liquides. Réglez l'injecteur au volume désiré pour injection (entre 9 et 50 nl nl). Générer contrôles blessant. Remplissez l'aiguille d'injecteur avec PBS stérile en insérant avec précaution la pointe de l'aiguille capillaire dans un tube des médias et pressing le bouton "remplir" sur l'injecteur. REMARQUE: Les milieux de culture stérile bactérienne peut également être utilisé si un contrôle blessant l'expérience requiert l'injection de bactéries en suspension dans leur milieu de croissance. Cependant, parce que le milieu de croissance bactérienne contient des composants qui peuvent stimuler le système immunitaire ou avoir d'autres effets sur l'hôte, un support inerte tel que du PBS est préférable. Anesthésier le nombre souhaité de mouches sous un flux lumineux de CO 2. Injecter les mouches dans l'abdomen antérieure sur la surface ventrolatérale avec le PBS stérile. NOTE: Il est également possible d'injecter des mouches à d'autres sites, tels que la plaque sternopleural du thorax, mais il est important de garder le site d'injection cohérente au sein de chaque expérience 17. Placez mouches injectés dans des flacons frais avec nouveau support, portant les flacons de leur côté jusqu'à ce que toutes les mouches ont récupéré de l'anesthésie pour empêcher les mouches de se coincer à la nourriture. <br /> NOTE: Il est recommandé d'injecter vol de contrôle PBS avant d'injecter des bactéries aux mouches expérimentales de sorte que la même aiguille peut être utilisé pour les deux traitements. Il ne sera pas toujours possible d'utiliser la même aiguille pour une expérience entière. Dans ce cas, il peut être souhaitable d'enregistrer aiguille qui a été utilisé avec laquelle les mouches et d'inclure aiguille identité en tant que facteur expérimental dans l'analyse statistique. Injecter la bactérie pathogène. Éjecter le média stérile reste de l'injecteur et de remplir la même aiguille avec la suspension bactérienne. Répétez la procédure ci-dessus (3.1.3), en injectant maintenant les mouches avec la suspension bactérienne préparée dans la procédure 2.2. 3.2) Avec septique Pinprick Préparer l'aiguille pour piquer. Faire fondre l'extrémité d'une pointe de micropipette 200 pi et insérer une broche insecte minuties 0,15 mm dans le plastique fondu. Laissez le plastique se solidifier such que la broche est maintenu en place avec environ 0,5 cm de tige étendant à partir de la matière plastique. Générer contrôles blessant. Anesthésier le nombre souhaité de mouches sous un flux lumineux de CO 2. Piquer les mouches dans la plaque sternopleural du thorax avec l'aiguille, en évitant les sites de fixation des ailes et les jambes. Si nécessaire, retirez délicatement les mouches de la broche minuties l'aide de pinces molles. REMARQUE:. Il est également possible de piquer les mouches à d'autres sites, comme l'abdomen antérieur sur la surface ventrolatérale, mais il est important de conserver le site d'injection conforme à l'intérieur de chaque expérience 17 Piquage à travers la cuticule de l'abdomen a tendance à être plus difficile que de piquer du thorax et est donc moins commun. Placez les mouches dressées dans un nouveau flacon par un nouveau milieu de volée, portant le flacon sur le côté jusqu'à ce que toutes les mouches ont récupéré de l'anesthésie pour empêcher les mouches de soitvenue collé à l'aliment. Présentez l'infection bactérienne. Anesthésier le nombre souhaité de mouches sous un flux lumineux de CO 2. Piquer chaque mouche dans le même endroit que les commandes multimédia, plongeant la pointe de la broche dans la suspension bactérienne préparée dans la procédure 2.2 avant de piquer chaque volée. Placez les mouches dressées dans un nouveau flacon par un nouveau milieu de volée, portant le flacon sur le côté jusqu'à ce que toutes les mouches ont récupéré de l'anesthésie pour empêcher les mouches de se coincer à la nourriture. 3.3) évaluer la dose infectieuse Livré Infecter un groupe de mouches comme décrit ci-dessus dans les deux procédures 3.1 ou 3.2, seulement au lieu de retourner à vol flacon alimentaire pour récupérer de l'anesthésie, placez chaque mouche dans un tube à centrifuger sur la glace. Ajouter 250 ul de PBS à chaque tube et homogénéiser vol soit au moyen d'un pilon ou un batteur à billes. </Li> Plaque le broyat sur une plaque de gélose LB, soit en utilisant un laminoir à spirale ou une dilution en série. À la plaque en utilisant une dilution en série, transférer chaque homogénat de volée à la première ligne d'une plaque de 96 puits. Remplir chaque puits des rangées restantes avec 90 ul de PBS. En utilisant une pipette multicanaux, prendre 10 pi de la première ligne contenant voler homogénat et distribuer dans la deuxième rangée. Pipette de haut en bas au moins 10 fois pour bien mélanger, puis prendre 10 pi et de transférer à la troisième rangée. Répétez cette procédure en utilisant les lignes restantes. A partir de la rangée du bas (les plus diluer suspension de bactéries), utiliser la pipette multicanaux de prendre 10 pi de chaque puits et le dépôt sur une plaque LB, en prenant soin que les échantillons sont distribués sous forme de taches discrètes qui ne se touchent pas. Répétez jusqu'à ce que tous les puits ont été échantillonnés à partir de chaque rangée, les distribuer dans l'ordre décroissant de dilution sur la plaque LB. </li> Laissez la plaque à température ambiante jusqu'à ce que les taches ont complètement trempée dans la plaque LB. REMARQUE: Le séchage de la plaque LB pendant quelques jours à la température ambiante avant utilisation est recommandé de veiller à ce que le liquide est rapidement absorbé, ce qui minimise les risques de contact accidentel entre les taches de l'échantillon. Incuber les plaques O / N, en prenant soin de ne pas envahir les plaques de manière colonies restent petites et discret. NOTE: Selon le milieu de croissance et température d'incubation bactérienne utilisée, colonies dérivées de la flore intestinale endogène de la mouche peuvent se déposer sur la plaque. Cependant, la plupart des bactéries utilisées pour l'infection pathogène se développent beaucoup plus vite que le microbiote intestinal sur gélose LB à 37 ° C. Retirer les plaques de l'incubateur lorsque les bactéries expérimentales ont grandi colonies visibles (généralement 8 à 12 h), mais avant la drosophile colonies intestin du microbiote apparaissent (environ 36 h). Pour les bactéries expérimentales à croissance lente, utiliser un sélectiveantibiotique de la gélose LB pour éliminer les colonies de la flore intestinale. Comptez le nombre de colonies pour chaque homogénat. Pour les plaques en spirale, compter les colonies qui poussent à l'aide d'un compteur de colonies automatisé qui permet d'estimer la charge bactérienne par ml d'homogénat basé sur le nombre et la position des colonies sur la plaque. REMARQUE: nombre de spirales sont plus précis quand la concentration bactérienne est de l'ordre de 5 x 10 2 à 5 x 10 4 bactéries par ml. Pour les plaques de place, compter manuellement les colonies pour chaque volée de dilution selon contient de 30 à 300 colonies et calculer le nombre de bactéries par ml d'homogénat d'origine. 4. Caractériser survie des maladies infectieuses la mortalité de dosage post-injection. Placez mouches infectées et les contrôles blessés dans des flacons frais et maintenir dans un incubateur à une température souhaitée (25 ° C avec une lig 12h12ht: cycle d'obscurité est recommandé). Ne mettez pas plus de 15 mouches dans un seul flacon comme il devient difficile de compter plus de 15 mouches de vie. Comptez le nombre de vivants et morts vol chaque jour, ou plus fréquemment si nécessaire. Afin de maintenir la qualité des aliments, retourner les mouches à de nouveaux aliments sur une base régulière. Si le flacon contient seulement les hommes, de les transférer dans des flacons frais tous les trois jours. Si le flacon contient femelles, transférer dans des flacons frais tous les deux jours parce que la progéniture des larves se liquéfier la nourriture, ce qui augmente le risque que les mouches adultes peuvent se coincer et entraînant des taux de mortalité surestimés en raison de l'infection. Analyser statistiquement les données. la survie de l'intrigue comme une courbe de Kaplan-Meier, qui indique la probabilité qu'un individu va survivre à une post-injection de temps point mesuré. 18 Pour les courbes de survie qui ne se croisent pas, effectuer des comparaisons par paires en utilisant un Log-Rank Test (aussi appelé test Mantel Cox) ou effectuer des analyses plus complexes en utilisant un modèle des risques proportionnels de Cox, qui peut intégrer plusieurs facteurs et de leurs interactions. Pour les courbes de survie qui se croisent, effectuer une analyse Cox stratifié. 17 5. essai bactérien Chargez post-infection Mesurer la charge bactérienne. Lors d'une post-injection de temps prescrite, répéter la procédure utilisée pour évaluer la dose infectieuse pour déterminer la charge bactérienne au cours de l'infection (voir le protocole 3.3). NOTE: Si vous utilisez le plaqueur en spirale, diluer homogénats de sorte que la suspension bactérienne situe dans une fourchette de 1000 – 100.000 bactérienne par ml. Analyser les données. Si la charge bactérienne est non-normale, soit transformer les données afin de mieux approximer une distribution normale ou analyser les données en utilisant une analyse statistique non paramétrique (par exemple test de Mann-Whitney U). Utilisez une analyse de Box-Cox à find la transformation optimale; journaux ou de base naturelle -10 transformations journaux sont souvent efficaces. 19 Si les données sont suffisamment distribués normalement et il ya seulement deux traitements étant contrastées, effectuer un t -test de déterminer si les deux traitements se traduisent par différentes charges bactériennes moyennes. Si il ya plusieurs variables expérimentales ou à d'autres facteurs potentiellement prédictifs, utiliser l'analyse de variance (Anova) pour déterminer quels sont les facteurs prédicteurs significatifs de la charge bactérienne. 19 6. Essai activation transcriptionnelle des gènes du système immunitaire Pour visualiser grossièrement activation immunitaire après une infection, infecter mouches transgéniques qui expriment la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle d'un promoteur d'un gène du peptide antimicrobien tel que décrit précédemment. 18 Voir les mouches infectées sous un microscope de fluorescence capable; GFP induction devrait devenir Visible dans le corps gras dans les 6 premiers – 10 heures après l'infection. Pour la quantification plus précise de l'activation immunitaire, utiliser la PCR quantitative sur le modèle d'ADNc (qRT-PCR) pour mesurer l'abondance des antimicrobiens transcrits du gène peptide. NOTE: L'expression des gènes immunitaires peut être mesuré à tout moment après (ou avant) infection. D'une manière générale, l'induction de l'expression du gène immunitaire commence environ 4 h après l'injection et augmente au cours de la prochaine 24 heures. Anesthésier vol utilisant le CO 2. Passer vol 15 dans un tube de microcentrifugation, pour chaque extraction d'ARN. NOTE: Il est recommandé de prélever au moins trois échantillons répétés pour chaque condition de traitement. Extraire l'ARN de vol et générer un ADNc premier brin en utilisant un quelconque d'un certain nombre de modes opératoires standard ou des kits commerciaux. ARN de magasin à -80 ° C. ADNc de magasin à -20 ° C pour des périodes de quelques semaines et à -80 ° C pour le stockage à long terme. Avant extraction de l'ARN, un magasin fse situe à -80 ° C. Effectuer la PCR quantitative (qPCR) sur des gènes cibles d'intérêt en utilisant l'ADNc comme matrice. Reportez-vous au tableau 1 pour les séquences d'amorces pour amplifier les gènes de peptides antibactériens Diptericin A, drosomicine, défensines, attacine A, et Metchnikowin ainsi que la rp49 de contrôle du gène de ménage (aussi connu comme rpl32). Remarque: les gènes codant pour les peptides antimicrobiens Diptericin A et drosomicine fournissent de très bons afficheurs de D. melanogaster activité immunitaire induite essentiellement par les voies IMD et Toll, respectivement. Afin de contrôler les variations échantillon à échantillon dans le rendement de l'ARN et l'efficacité de la transcription inverse, de normaliser l'expression enregistrée de gènes cibles contre un gène de ménage de référence dont l'expression ne devrait pas changer avec infection comme rp49 (aussi connu comme RPL 32). Analyser les données. <ol> Pour approximation des différences d'expression, calculer le rapport de la quantité de départ (SQ) valeur obtenue à partir du gène d'essai (par exemple, Diptericin A) par rapport à la valeur de SQ obtenue à partir du gène de référence (par exemple, rp49) pour chaque échantillon (calculée en tant que SQ – DPTA / SQ – rp49). Echelle ces rapports à un traitement de commande de ligne de base tel qu'un contrôle de la manipulation non infecté. Fixer arbitrairement le niveau d'expression de contrôle égal à 1,0 et de visualiser des traitements expérimentaux que les changements relatifs de pliage. Estimer la valeur de la SQ pour chaque gène contre une courbe standard générée à partir d'une série de dilution de la quantité connue-ADNc. REMARQUE: L'analyse statistique des rapports peut être compliqué, donc cette approche est meilleure pour approximation rapide que pour une analyse rigoureuse. Si l'efficacité PCR est faible, concevoir de nouvelles amorces pour améliorer la cinétique de PCR si possible. Pour les réactions de qPCR avec une efficacité quasi-parfaite (adoubling de produit PCR à chaque cycle), le cycle de seuil (C T) peut être remplacé par la valeur de la SQ. Pour les expériences simples avec amplification d'une efficacité optimale, les données peuvent être analysés en utilisant la méthode ΔΔC T. 19 Pour chaque échantillon, il faut soustraire la valeur C T du gène de référence (par exemple, rp49) de la C T du gène de test (par exemple., Diptericin A) pour donner un Ac T. Puis soustraire l'Ac T de la commande de base de l'Ac T pour chaque échantillon expérimental pour donner une valeur ΔΔC T pour chaque échantillon; ce ΔΔC T est révélateur des différences relatives dans les niveaux d'expression des gènes entre les traitements, où 2 (-ΔΔCT) se rapproche le changement fois de l'expression. NOTE: changement rabattable Cette analyse peut mal misestimate dans l'expression du gène cible si le PCR soit le gène de test ou la référencegène a une faible efficacité. Pour l'analyse le plus rigoureux, effectuer une analyse de variance (ANOVA) en utilisant l'expression estimée du gène d'essai (par exemple Diptericin A) comme variable de réponse et d'expression d'environ le gène de contrôle (par exemple, rp49) et d'autres facteurs expérimentaux comme variables explicatives. NOTE: Cette approche est relativement robuste à l'inefficacité dans l'amplification PCR et permet l'analyse des modèles expérimentaux plus complexes.