全身细菌感染与免疫防御的表型<em>果蝇</em

1.收集和准备苍蝇后排D.所需的实验条件下果蝇 。小心不要饲养过程中过度拥挤的苍蝇和确保幼虫密度在整个治疗一致的，因为在幼虫阶段的环境条件下可以在成年阶段深刻地影响免疫防御的表型。15 收集实验苍蝇0 – 羽化后3天从蛹壳，并将其转移到新鲜的培养基。 房子所收集的蝇在所需的温度（温度之间22°C和28°C通常是合适的），直到它们被熟化5 – 后7天羽化。 注：这允许足够的时间过得完成蜕变，成为成熟的成年人，但也衰老开始之前。 苍蝇的期望数量的分类到感染前的单独小瓶中，再次注意避免过度拥挤。 注：只有马文件被感染在此示范但同样可能感染使用描述的方法的女性。 2.文化和准备细菌准备选择的​​细菌至少2天前感染的主板块。条纹从15％甘油贮存在-80℃下无限期储存细菌。存储主板在4℃下长达2周。始终连胜主板直接从冷冻甘油股票。避免细菌的串行通道从板到，在文化路重复可造成细菌进化毒力减弱。 注：本示例利用雷氏普罗威登斯菌和大肠杆菌 。 使用以下步骤准备菌悬液注射。 通过接种无菌介质单菌落从主隔离板成长2 ml培养的细菌。生长的细菌固定相（ 如 </em> O / N的增长，在37°C）。 注：两个P.雷氏普罗威登斯菌和大肠杆菌的Luria肉汤中生长良好，在温度为20 – 37℃下柔和摇动。 一旦培养达到稳定期，轻轻地从约沉淀细胞。 600微升的培养物在台式离心机（3分钟，在5000×g离心），弃上清，重悬的细菌大约1000微升无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS; 137mM的氯化钠，2.7毫米氯化钾，10毫的Na 2 PO 4，1.8毫KH 2 PO 4，pH值= 7.4）。 稀释的悬浮细胞在无菌PBS以达到光密度（OD）适当的细菌被使用，用分光光度计作为吸光度在600nm测定。使用此悬挂感染的苍蝇。 注：600 = 0.1或1.0分别对应于约10 8和10 9 雷氏普罗威登斯菌或E.每毫升大肠杆菌 。由于两人住一第二死细菌有助于光密度，它在固定相早期收获培养细菌尸体积累之前和歪曲光密度和感染过程中引入的活菌数之间的关系是很重要的。 3.感染蝇注：由于果蝇的免疫受昼夜节律的影响，它在整个实验重复每天的同一时间进行感染是非常重要的16。 3.1）用Nanoinjector 准备玻璃针感染。 通过使用微量拉马拉硼硅玻璃毛细管制成玻璃针。 使用镊子，断绝针的尖端，以产生大约50微米直径的开口，以允许液体喷射。 组装的注射器。 将密封O形环，然后将白色菌宏碁（大酒窝朝外）在金属活塞。 填充玻璃针用矿物油使用与地下30针的注射器。 把填充玻璃针穿过筒夹，然后将较大的O形环围绕其基部，大约从针的钝端1毫米。 针滑入金属柱塞，轻轻拧上夹头，直到安全。 喷射大多数矿物油从喷射器，但要确保仍有一小体积的油中的针充当喷射器和细菌悬浮液之间的屏障。确保有矿物油或细菌悬浮液内没有气泡，或两种液体之间。 喷射器设置成用于注射的所需体积（9 NL和50 NL之间）。 产生伤人的控制。 通过仔细插入毛细管针的尖端在媒体和pressi的管填充注射器针头用无菌PBS纳克在喷油器的“填充”按钮。 注：无菌细菌生长培养基也可以使用一个伤人控制，如果实验需要注射的细菌悬浮于它们的生长培养基中。但是，由于细菌的生长介质包含部件可以刺激免疫系统或具有在主机上其它影响，惰性载体如PBS中是优选的。 麻醉下的 CO 2的光流的苍蝇的期望数量。 注入上腹外侧表面与无菌PBS苍蝇于前腹部。 注意：也可以注入苍蝇在其它部位，如胸廓sternopleural板，但为了保持注射部位各实验内一致是很重要的17。 将注入苍蝇到新鲜小瓶新媒体，铺设在自己身边的小瓶，直到所有的苍蝇都从麻醉中恢复，以防止苍蝇从被卡的食物。<BR />注：建议将注入细菌实验苍蝇所以同样的针可以同时用于治疗前注入PBS控制苍蝇。它并不总是有可能使用相同的针对整个实验。在这种情况下，可能希望记录哪些针被用来与飞并包括作为实验因子在统计分析针身份。 注入细菌病原体。 喷射从喷射剩余的无菌介质和填充同一针与细菌悬浮液。 重复上述步骤（3.1.3），现在的注射用蝇菌悬液的过程中准备2.2。 3.2）感染性针刺准备针刺。 融化200微升微量移液器尖端的端部，并插入一个0.15毫米昆虫minutien销入熔融塑料。让塑料凝固苏通道，所述销被保持在适当位置以从塑料延伸大约0.5厘米销。 产生伤人的控制。 麻醉下的 CO 2的光流的苍蝇的期望数量。 刺苍蝇与针胸廓sternopleural板，避免了翼和腿部的连接位点。如果有必要，温和地去除苍蝇用软钳minutien引脚。 注意：也可以刺破苍蝇在其它部位，如在腹外侧表面的前腹部，但为了保持注射部位各实验内一致是很重要的17至腹部的角质层刺更趋于难比穿刺胸廓的，因此是不常见的。 将一竖苍蝇到一个新的小瓶新飞媒介，奠定在其一侧的小瓶，直到所有的苍蝇都从麻醉中恢复，以防止苍蝇从以下到来粘在食品。 介绍了细菌感染。 麻醉下的 CO 2的光流的苍蝇的期望数量。 每一个刺在同一位置作为媒体控制飞行，浸渍销的尖端插入菌悬液各刺起飞前准备程序中的2.2。 将一竖苍蝇到一个新的小瓶新飞媒介，奠定在其一侧的小瓶直到所有的苍蝇从麻醉中已经恢复，防止苍蝇从被卡的食物。 3.3）评估的感染剂量交付感染作为任一过程3.1或3.2以上述唯一的而不是返回苍蝇食物小瓶从麻醉中恢复，一组苍蝇，将每个飞入冰上一个离心管中。 微升的PBS，加入250至每个管并用杵或珠打浆机均质苍蝇任</ LI> 镀上的LB琼脂平板匀浆，或者使用一个螺旋接种仪或系列稀释。 制版用系列稀释，每飞匀浆转移到96孔板的第一行。 填补剩余的行每孔90微升PBS。 使用多道移液器，取10微升含有飞匀浆，分装到第二行的第一行。 移液器上下至少10次调匀，再取10微升，并转移到第三排。利用剩余的行重复此过程。 从底行（最稀的细菌悬浮液）开始，可使用多道移液器采取从每个孔中并沉积10微升在LB板上，小心不使样品被分配作为离散斑点不互相接触。重复，直到所有的井都被取样的每一行，配药他们降序排列稀释的LB平板。 </li> 离开板在室温，直至斑​​已经完全浸透到LB平板。 注：干燥的LB平板在室温使用前几天，建议确保液体很容易被吸收，减少的样本点之间的意外接触的机会。 孵育板O / N，注意不要过度生长板使菌落保持小而分散。 注意：根据所用的细菌生长培养基和温育温度，从果蝇的内源性肠道微生物衍生的菌落，最终可能会出现在平板上。然而，用于病原感染大多数细菌生长速度比在37℃下在LB琼脂肠道菌群快得多。 从孵化器中取出印版时，实验细菌生长可见菌落（一般为8 – 12小时），但在果蝇肠道微生物菌落出现（约36小时）。对于生长缓慢的细菌实验，使用选择性抗生素在LB琼脂从肠道微生物除去任何菌落。 算为每匀浆菌落数。 为螺旋板，计数生长使用自动菌落计数器，可以每ml匀浆基于在板的菌落数及位置估计细菌负荷的菌落。 注：螺旋计数是最准确的，当细菌浓度在每毫升5×10 2〜5×10 4个细菌的范围内。 现货板，手动计数每个飞从哪个稀释后含有30菌落 – 300菌落并计算每毫升原匀浆的细菌数。 感染4.检定存活测定死亡率后喷射。 将受感染的苍蝇和受伤的控制在新鲜小瓶中并在培养箱中在期望的温度保持（25℃，12:12韧带HT：暗周期推荐）。不把超过15蝇成单一小瓶当它变得难以计数超过15生活苍蝇。 每一天算生活和死苍蝇的数量，或更频繁，如果合适。 为了保持食品质量，翻转苍蝇新的食品定期调度。 如果管含有只有男性，他们转移到新鲜小瓶每三天。如果样品瓶中含有女性，转移到新鲜小瓶每隔两天，因为幼虫后代将液化的食品，增加了风险成蝇可能卡住并导致死亡因​​感染高估率。 统计分析数据。 情节生存作为采用Kaplan-Meier曲线，这表明使用对数秩t的个体将生存于测量时间点后喷射。18对于存活曲线不交叉，执行成对比较的概率EST（也称为曼特尔考克斯测试）或执行采用Cox比例风险模型，它可以包含几个因素及其相互作用更复杂的分析。对于跨生存曲线，进行分层Cox分析。17 5.测定细菌负荷感染后测量细菌负荷。 在规定的时间后喷射，重复用于评估感染剂量，以确定细菌负荷在感染过程的程序（见协议3.3）。 注意：如果使用的是螺旋接种仪，稀匀浆使菌悬液落在范围内的1000 – 100000细菌每毫升。 分析数据。 如果细菌荷载是非正常的，或者变换该数据，以便更接近正态分布或分析使用非参数统计分析（ 例如，采用Mann-Whitney U检验）的数据。使用箱Cox分析到fIND的最优变换;自然对数或碱-10日志转换往往是有效的。19 如果数据被充分正态分布和仅存在两个被对比处理，执行t检验 ，以确定两种治疗是否导致不同的平均细菌载量。如果有多个实验变量或其他潜在预测因素，使用方差分析（ANOVA）来确定哪些因素是细菌负荷显著预测因子。19 免疫系统的基因分析6转录激活粗略地显现免疫激活感染后，感染的转基因果蝇表达从抗微生物肽基因的启动子的控制下的绿色荧光蛋白（GFP），如前所述。18 查看被感染的苍蝇荧光功能的显微镜下; GFP感应应该成为visib在文件中的第一个6脂肪体 – 感染后10小时。 对于免疫激活的更精确的量化，使用的cDNA模板（定量RT-PCR）荧光定量PCR来衡量的抗菌肽基因转录的丰度。 注：免疫基因的表达可以在后（或之前）感染的任何时间进行测量。一般来说，感应免疫基因表达的，在未来24小时开始注射，并增加后约4小时。 麻醉蝇使用CO 2。 将15苍蝇进入离心管的每个RNA提取。 注：建议收集至少有三个重复样品，每个处理条件。 从果蝇提取RNA和使用任何数目的标准方法或市售试剂盒产生第一链cDNA。商店的RNA在-80℃。商店的cDNA在-20℃下的几个星期期间和在-80℃下长期贮存。之前RNA提取，存储˚F在于在-80℃。 感兴趣使用cDNA为模板的靶基因进行定量PCR（qPCR的）。请参阅表1引物序列扩增抗菌肽基因Diptericin A，Drosomycin，防御 ， 家蝇Attacin A和Metchnikowin以及管家对照基因RP49（又称RPL32）。 注：编码抗菌肽Diptericin A和Drosomycin的基因D.提供很好的读数果蝇诱导主要通过IMD的和Toll途径免疫活性，分别。为了控制对样本-样本变化在RNA得率和反转录的效率，规范记录表达靶基因与参考管家基因的表达预期不会更改与感染如RP49（也称为RPL 32）。 分析数据。 <OL> 用于表达的差异粗略近似，计算从测试基因获得的起始量（SQ）的值的比率（ 例如，Diptericin A）中相对于从参考基因得到的SQ值（ 例如，RP49）对于每个样品（换算为SQ – DPTA / SQ – RP49）。这些缩放比率为基线控制处理，如感染处理控制。任意设定控制表达水平等于1.0和可视化实验性治疗的相对倍数变化。估计为针对从系列稀释的已知-量的cDNA产生的标准曲线的每个基因的SQ值。 注：比例的统计分析可以是复杂的，所以这种方式是更好地为快速近似比严格的分析。如果PCR效率低，设计新的引物，以改善的PCR动力学如果可能的话。对于qPCR的反应与近乎完美的效率（广告PCR产物每个周期）的oubling，阈值循环（C T），可被取代的SQ值。 对于简单的实验与优化有效扩增，数据可以使用ΔΔCT法进行分析。19对于每个样品，从测试基因的（C T）（ 例如，Diptericin减去参照基因的（C T）值（ 例如，RP49） A）以产生ΔC 吨 。然后减去从ΔCT表示每个实验样品以产生ΔΔC 的T值各样品的基线对照的ΔC 笔 ;这ΔΔCT是指示治疗，其中2（-ΔΔCT）近似表达的倍数变化之间的基因表达水平的相对差异。 注意：此分析可以严重misestimate折叠改变靶基因的表达，如果任一测试基因或参考的PCR基因具有低效率。 为最严格的分析，使用测试基因（ 例如Diptericin A）中作为响应变量的和所估计的表达对照基因（ 例如，RP49）和其它实验因素作为解释变量的估计表达式进行方差分析（ANOVA）分析。 注：此方法是在PCR扩增相对强劲效率低下，并允许更复杂的实验设计分析。